Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản nuôi tại huyện văn chấn tỉnh yên bái, ứng dụng kỹ thuật RT PCR trong chuẩn đoán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN MINH THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN NUÔI TẠI HUYỆN VĂN CHẤN –

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN MINH THANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN NUÔI TẠI HUYỆN VĂN CHẤN – TỈNH YÊN BÁI, ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR TRONG CHẨN ðOÁN

LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN MINH THANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN NUÔI TẠI HUYỆN VĂN CHẤN – TỈNH YÊN BÁI, ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR TRONG CHẨN ðOÁN

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60.64.01.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan

Hà Nội - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Tác giả luận văn

Nguyễn Minh Thanh

LỜI CẢM ƠN

Cho ựến nay tôi ựã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình Nhân dịp này tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến toàn thể thầy cô giáo trong khoa Thú y, ựặc biệt PGS.TS Nguyễn Thị Lan người hướng dẫn khoa học và tận tình giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Bộ môn Bệnh lý Thú y, phòng thắ nghiệm Trọng ựiểm Công nghệ sinh học thú y, Ban quản lý đào tạo

ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến gia ựình, bạn bè ựồng nghiệp ựã giúp ựỡ, ựộng viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thiện luận văn

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Tác giả luận văn

Nguyễn Minh Thanh

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

MỞ ðẦU 1

Tính cấp thiết của ñề tài 1

Mục ñích của ñề tài 2

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về lịch sử và tình hình nghiên cứu Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên lợn 3

1.1.1 Khái quát về lịch sử hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu PRRS trên thế giới và trong nước 5

1.2 Virus PRRS 10

1.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS 10

1.2.2 Phân loại virus PRRS 12

1.2.3 Sức ñề kháng của virus PRRS 13

1.3 Dịch tễ học của bệnh 13

1.3.1 ðộng vật cảm nhiễm 13

1.3.2 Phương thức lây truyền 14

1.3.3 Cơ chế sinh bệnh 15

1.4 Triệu chứng của lợn mắc PRRS 17

1.4.1 Lợn nái 17

1.4.2 Lợn ñực giống 17

1.4.3 Lợn con theo mẹ 17

1.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai 18

1.5 Bệnh tích của lợn mắc PRRS 18

1.5.1 Lợn nái mang thai 18

1.5.2 Lợn nái nuơi con, lợn choai và lợn vỗ béo 18

1.5.3 Lợn con theo mẹ 18

1.6 Các phương pháp chẩn đốn PRRS 19

1.6.1 Chẩn đốn lâm sàng 19

1.6.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh 19

1.6.3 Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học 19

1.6.4 Kỹ thuật RT - PCR 20

CHƯƠNG II ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ðối tượng và địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Nguyên liệu 22

2.3.1 Mẫu bệnh phẩm 22

2.3.2 Hĩa chất 22

2.3.3 Dụng cụ 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp quan sát 23

2.4.2 Phương pháp mổ khám 23

2.4.3 Phương pháp làm tiêu bản kiểm tra bệnh tích vi thể 23

2.4.4 Phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) 26

2.4.5 Phương pháp RT-PCR 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Khái quát về điều kiện Tự nhiên - Kinh tế - Xã hội huyện Văn Chấn 30

3.2 Tình hình chăn nuơi lợn tại huyện Văn Chấn 33

3.3 Tình hình dịch bệnh và sử dụng các loại vaccine trên đàn lợn tại huyện Văn Chấn 35

3.4 Tình hình hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản trên đàn lợn nuơi tại huyện Văn Chấn 37

3.4.1 Nguyên nhân, ổ dịch ñầu tiên và diễn biến dịch hội chứng rối loạn hô

hấp và sinh sản ở lợn trên ñịa bàn huyện Văn Chấn 37

3.4.2 Tổng hợp chung tình hình Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở ñàn lợn nuôi trên ñịa bàn huyện Văn Chấn năm 2012 37

3.5 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS 41

3.6 Biến ñổi bệnh lý của lợn mắc PRRS 48

3.6.1 Bệnh tích ñại thể của lợn mắc PRRS 48

3.6.2 Bệnh tích vi thể của lợn mắc PRRS 52

3.7 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch trên một số cơ quan của lợn mắc PRRS 58

3.8 Kết quả xác ñịnh virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR 63

3.8 Kết quả xác ñịnh virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR 63

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 65

Kết luận 65

ðề nghị……… 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

6 PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome

7 PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

8 RT-PCR Reverse transcription polymerasae chain reaction

9 TCID50 50% Tissue culture infective dose

DANH MỤC BẢNG BIỂU

STT TÊN BẢNG TRANG

Bảng 3.1 Tình hình đàn lợn tính đến cuối tháng 2/2012 tại 31 xã, thị trấn

huyện Văn Chấn .34

Bảng 3.2 Tình hình sử dụng các loại vaccinetrên đàn lợn nuơi tại huyện Văn Chấn. 36

Bảng 3.3 Tổng hợp tình hình Hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản ở đàn lợn trên địa bàn huyện Văn Chấn năm 2012 40

Bảng 3.4 Kết quả thu thập mẫu tại xã Phúc Sơn và Hạnh Sơn huyện Văn Chấn 41

Bảng 3.5 Triệu chứng lâm sàng của lợn nái mắc PRRS 42

Bảng 3.6 Triệu chứng lâm sàng của lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa, lợn choai mắc PRRS 43

Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS 48

Bảng 3.8 Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi của lợn mắc PRRS 54

Bảng 3.9 Bệnh tích vi thể ở gan, lách, thận của lợn mắc PRRS 55

Bảng 3.10 Bệnh tích vi thể ở ruột, hạch ruột, tử cung của lợn mắc PRRS 56

Bảng 3.11 Kết quả nhuộm hĩa mơ miễn dịch một số cơ quan của lợn mắc PRRS 61

Bảng 3.12 Kết quả chẩn đốn virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR 64

DANH MỤC HÌNH ẢNH

STT TÊN HÌNH TRANG

Hình 1.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 4

Hình 1.2 Hình thái Virus PRRS 11

Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS 11

Hình 1.4 ðại thực bào bình thường 16

Hình 1.5 ðại thực bào bệnh lý 16

Hình 1.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 20

Hình 3.1 Nái bị sảy thai 47

Hình 3.2 Lợn sốt, chán ăn 47

Hình 3.3 Lợn khó thở 47

Hình 3.4 Tím tai 47

Hình 3.5 Lợn con tiêu chảy 47

Hình 3.6 Lợn bị phát ban 47

Hình 3.7 Phổi viêm, hoại tử 51

Hình 3.8.Tím tai 51

Hình 3.9 Hạch lâm ba sưng, tụ máu 51

Hình 3.10 Thận xuất huyết ñiểm 51

Hình 3.11 Hạch lâm ba sưng, tụ máu 51

Hình 3.12 Lách nhồi huyết 51

Hình 3.13 Viêm kẽ phồi 57

Hình 3.14 Viêm kẽ phồi 57

Hình 3.15 Hạch lâm ba viêm, hoại tử 57

Hình 3.16 Hạch lâm ba viêm, hoại tử 57

Hình 3.17 Thận xuất huyết 57

Hình 3.18 Thận xuất huyết 57

Hình 3.19 Virus tập trung ở phổi (IHCx10 62

Hình 3.20 Virus tập trung ở phổi (IHCx40) 62

Hình 3.21 Virus phân bố ở hạch (IHCx10) 62

Hình 3.22 Virus phân bố ở hạch (IHCx40) 62

Hình 3.23 Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 64

MỞ ðẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản ở lợn - PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome) hay cịn được gọi là “bệnh tai xanh ở lợn”, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguy hiểm đối với lợn Bệnh cĩ tốc

độ lây lan nhanh, đặc biệt là gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi PRRS khơng chỉ gây chết lợn do làm suy giảm miễn dịch mắc phải mà nĩ cịn tạo điều kiện cho các vi sinh vật khác xâm nhập và gây bệnh

Ở Việt Nam, sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất to lớn cho ngành chăn nuơi lợn Dịch bệnh xảy ra đầu tiên vào tháng 3/2007 tại Hải Dương (Cục Thú y, 2007 [1]) Từ đĩ đến nay, bệnh xảy ra liên tiếp trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam với diễn biến rất phức tạp, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho các hộ chăn nuơi, ngồi ra dịch bệnh cịn tạo tâm lý hoang mang cho cả người chăn nuơi cũng như người tiêu dùng trong nước

Năm 2012 bệnh đã xảy ra trên địa bàn tỉnh Yên Bái, huyện Văn Chấn

là một trong những huyện chịu ảnh hưởng lớn từ dịch tai xanh xảy ra trên địa bàn tỉnh

Văn Chấn là một huyện miền núi, nền kinh tế chủ yếu dựa vào các sản phẩm trồng trọt, chăn nuơi Do dịch xảy ra lần đầu tiên nên người chăn nuơi chưa hiểu hết về tính chất nguy hiểm của dịch nên cịn chủ quan trong cơng tác phịng chống, khơng khai báo kịp thời khi lợn bị bệnh, cán bộ làm cơng tác Thú y khơng chẩn đốn ra bệnh Dịch bệnh xảy ra gây ảnh hưởng lớn tới đời sống và tâm lý cho các hộ chăn nuơi nĩi riêng và địa phương nĩi chung Bên cạnh đĩ, virus cịn cĩ thể tồn tại trong những đàn, những cá thể đã cảm nhiễm bệnh nhưng khơng cịn biểu hiện triệu chứng bệnh gây nhiều khĩ khăn cho cơng tác thanh tốn bệnh trên thực tế

Vì vậy, việc nắm rõ những đặc điểm bệnh lý, triệu chứng lâm sàng của lợn nuơi tại địa bàn huyện Văn Chấn và những hậu quả do dịch gây ra trên đàn lợn là một việc quan trọng để từ đĩ đưa ra những biện pháp phịng chống dịch hiệu quả và giảm thiểu những tổn thất do dịch bệnh gây ra

Xuất phát từ những thực tế trên chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài:

" Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản nuơi tại huyện Văn Chấn - tỉnh Yên Bái, ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đốn "

Mục đích của đề tài

- Làm rõ một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc hội chứng rối loạn

hơ hấp và sinh sản nuơi tại địa bàn huyện Văn Chấn - Tỉnh Yên Bái

- Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đốn bệnh

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Cung cấp các thơng tin nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc chẩn đốn, phịng và chống dịch bệnh cĩ hiệu quả

- Tạo cơ sở để giúp các nhà quản lý, hộ chăn nuơi đưa ra các biện pháp tái đàn nhanh chĩng và bền vững sau khi dịch xảy ra, giúp nâng cao hiệu quả trong chăn nuơi

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về lịch sử và tình hình nghiên cứu Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên lợn

1.1.1 Khái quát về lịch sử hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS)

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi (lợn nái, lợn con theo mẹ, lợn con sau cai sữa, lợn choai, lợn thịt và lợn ựực giống) Triệu chứng lâm sàng ựặc trưng ở cơ quan hô hấp và sinh sản Lợn nái chửa bị bệnh, dấu hiệu rõ nhất là sảy thai, ựẻ non, thai chết lưu, lợn sinh ra chết yểu, chậm ựộng dục trở lại sau cai sữa (đào Trọng đạt, 2008 [3]) Tỷ lệ bị bệnh, tỷ lệ chết cao hay thấp phụ thuộc vào lứa tuổi mắc, sức ựề kháng của con vật và ựiều kiện chăm sóc nuôi dưỡng Bệnh có tốc ựộ lây lan nhanh Lợn bị bệnh thường kế phát các bệnh Dịch tả lợn, Phó thương hàn lợn, Tụ huyết trùng lợn, bệnh do E.coli, Streptococcus suis, suyễn lợn

Bệnh xuất hiện ựầu tiên ở Mỹ năm 1987 tại vùng bắc của bang Califonia, bang Iowa và Minnesota (Keffaber, 1989[24], Loula,1991[25]) Rất nhanh chóng, năm 1988, bệnh lây sang Canada, sau ựó lan sang các nước Châu Âu: đức 1990; Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991; Pháp 1992 (OIE,2005[33])

Hình 1.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

Năm 1988, bệnh phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc Châu Á [27,41] Lúc ñầu do căn bệnh chưa ñược biết chắc chắn nên ñược gọi với nhiều tên khác nhau: Bệnh thần bí ở lợn - Mistery Swine disease (MSD); Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn - Swine infertility and respiratory disease (SIRS); Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn - Porcine Endemic Abortion and Respiratory syndrome (PEARS); Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

- Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome (PRRS) và "Bệnh tai xanh

ở lợn"- Blue Ear Disease(BED)

Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này ñược tổ chức tại St Paul Minesota (Mỹ), Tổ chức Thú y thế giới ñã nhất trí gọi là Hội chứng rối loạn

hô hấp và sinh sản ở lợn - Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome (PRRS) (William T Christianson, Han Soo Joo, 2001[12]

Ở Trung Quốc, PRRS ñã liên tục xảy ra và hiện vẫn ñang còn tồn tại Trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng PRRS virut ñộc lực cao ñã gây ra ñại dịch lây lan ở hơn 10 tỉnh phía Nam và làm hơn hai triệu con lợn ốm, trong

ñó có khoảng hơn 400.000 con ñã chết ðến tháng 7 năm 2007, dịch bệnh ñã xảy

ra ở 25 tỉnh với hơn 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con ñã bị chết

Ở Việt Nam, theo thông báo của Cục Thú y, 2007 [2] các kết quả ựiều tra huyết thanh học tại một số trại lợn giống của các tỉnh phắa Nam ựã phát hiện có sự lưu hành của PRRS virut chủng cổ ựiển, ựộc lực thấp PRRS ựã xuất hiện và lưu hành tại nước ta từ năm 1997 Tuy nhiên sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất ựáng báo ựộng cho ngành chăn nuôi lợn thực sự mới bắt ựầu từ tháng 3 năm 2007

1.1.2 Tình hình nghiên cứu PRRS trên thế giới và trong nước

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

đã có nhiều nghiên cứu về ựặc ựiểm dịch tễ học, căn bệnh, cơ chế sinh bệnh, triệu chứng, bệnh tắch của PRRS và biện pháp phòng chống

Nelson EA, Christopher - Henning J, Drew T, Wensvoort G, Collins JE, Benfield DA, 1993 [30] trên cơ sở phân tắch cấu trúc gen của các chủng PRRSV phân lập từ các vùng ựịa lý khác nhau ựã xác ựịnh ựược 2 nhóm virut là:

- Nhóm 1: Gồm những virut thuộc dòng Châu Âu, ựại diện là chủng Lelystad, gồm 4 subtyp

- Nhóm 2: Gồm những virut thuộc dòng Bắc Mỹ, ựại diện là chủng virut

2332

Meng XJ và cs [26]; Kapur V và cs 1996 [23], bằng kết quả phân tắch trình tự nucleotid và axit amin của VR 2332 và virut Lelystad cho rằng các virut này ựang tiến hoá do ựột biến ngẫu nhiên và do tái tổ hợp trong gen

Kết quả nghiên cứu của Thanawongnuwech R và cs, 1998 [36] cho biết thời gian nhiễm trùng huyết, tốc ựộ bài thải và tái sản trong ựại thực bào của PRRSV ở lợn 4 ựến 8 tuần tuổi dài hơn so với lợn 16 ựến 24 tuần tuổi

Theo Wills RW và cs, 1997 [44] khi bị nhiễm PRRSV sẽ làm tăng tắnh

mẫn cảm của lợn ựối với Streptococcus suis serotyp 2, và làm trầm trọng thêm tình trạng bệnh do Salmonella choleraesuis trong cơ thể lợn khi có kế phát

Rất nhiều nhà khoa học quan tâm ñến việc truyền lây của PRRSV Theo các tác giả, PRRSV có thể truyền lây trực tiếp và truyền lây gián tiếp

*) Truyền lây trực tiếp:

Các ñường truyền lây trực tiếp của PRRSV trong và giữa các quần thể lợn bao gồm cả lợn nhiễm bệnh và tinh dịch bị vấy nhiễm PRRSV ñược phát hiện từ nhiều loại chất tiết và các chất thải từ lợn, bao gồm máu, tinh dịch, nước bọt, dịch họng, phân, nước tiểu, hơi thở ra, sữa và sữa ñầu (Wills RW và

cs, 2003 [45]

Sự truyền lây theo chiều dọc xảy ra trong suốt giai ñoạn cuối của thời

kỳ mang thai Qua nghiên cứu, nhiều nhà khoa học cho rằng khả năng qua nhau thai của virut phụ thuộc vào giai ñoạn mang thai của lợn nái khi virut xâm nhập vào cơ thể chúng Nếu virut xâm nhập vào con nái ñang chửa kỳ 1 hoặc ñầu kỳ 2 thì khả năng qua nhau thai của virut là rất thấp, thể hiện ở ñàn con sinh ra tỷ lệ chết thấp, tỷ lệ thai chết lưu cũng thấp, có con non hầu như không có triệu chứng bệnh Nếu virut xâm nhập vào những con nái ñang chửa

kỳ 2 thì khả năng qua ñược nhau thai là rất cao Chúng thường gây chết lợn

mẹ, hoặc tăng tỷ lệ thai chết lưu, ñẻ non, con non chết yểu nhiều, tỷ lệ cai sữa thấp Hiện tượng này ñược giải thích là do tính thấm của nhau thai ở các giai ñoạn khác nhau của thai kỳ (Wills RW và cs,2003 [45])

PRRSV có thể truyền ngang qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn bệnh và lợn cảm nhiễm cũng như sự lây truyền qua tinh dịch của lợn ñực nhiễm bệnh Yeager [45] ñã sử dụng tinh trùng lấy từ 2 lợn ñực xác ñịnh có virut huyết sau 5 ngày gây nhiễm, thụ tinh nhân tạo cho 2 nái tơ Kết quả là 2 nái tơ này ñã có phản ứng huyết thanh dương tính với PRRSV Swenson [42] ñã gây bệnh thành công bằng cách lấy tinh trùng của 4 lợn ñực nhiễm PRRSV tiêm vào xoang bụng lợn con từ 4-6 tuần tuổi Christopher-Hennings J, 1998 [19] dùng tinh dịch lấy từ lợn ñực 43 ngày sau khi gây nhiễm tiêm cho lợn mẫn

Nhiều nhà khoa học ñã khẳng ñịnh, ñặc trưng của PRRSV là nhiễm trùng kéo dài ðây là một ñặc trưng của nhóm Arterivirut Sự tồn tại dai dẳng của PRRSV gây ra lây nhiễm "âm ỉ", virut hiện diện ở mức ñộ thấp nhất trong

cơ thể và giảm dần theo thời gian (Wills, 1997 [43])

Cơ chế mà virut sử dụng ñể tấn công vào hệ thống miễn dịch của cơ thể chưa ñược làm rõ Thời gian tồn tại của virut ñược nói ñến trong nhiều nghiên cứu, nhưng kết quả khác nhau Sử dụng phản ứng khuyếch ñại gen (PCR) ARN ñã phát hiện ở lợn ñực hậu bị (6-7 tháng tuổi) PRRSV tồn tại tới 120 ngày sau khi gây nhiễm (Batista, 2002 [15]) và bài thải virut sang ñộng vật khác kéo dài ñến 36 ngày (Bierk, 2001 [17])

Về thời gian tồn tại của PRRSV trong quần thể: Bằng gây bệnh thực nghiệm, Horter DC, 2002 [22] ñã phát hiện ñược PRRSV trong 100% cá thể trong tổng số 60 lợn 3 tuần tuổi sau 63 ngày gây nhiễm và 90% sau 105 ngày gây nhiễm

Nếu lợn mẹ bị nhiễm bệnh trong khoảng 85-90 ngày của giai ñoạn mang thai, PRRSV có thể nhiễm sang bào thai, lợn con sinh ra mắc bệnh bẩm sinh ngay sau khi sinh Trong những trường hợp này, ARN của PRRSV ñược phát hiện trong huyết thanh vào ngày 120 sau khi ñẻ (Benfield D, 1992 [16]) Lợn chỉ báo ñược nhốt lẫn với những lợn mắc bệnh này (98 ngày sau khi sinh) ñã phát hiện kháng thể PRRSV vào ngày 14 sau ñó (Benfield D, 1992 [16]) Sự tồn tại dai dẳng của PRRSV trong từng cá thể dao ñộng trong khoảng thời gian từ 154 ñến 157 ngày sau khi nhiễm [22,12]

*) Truyền lây gián tiếp

Nhiều thông báo cho rằng dụng cụ, thiết bị, ủng và quần áo bảo hộ của công nhân chăn nuôi là những nguồn mang PRRSV tiềm tàng lây nhiễm cho lợn mẫn cảm (Otake,2002 [34]

Theo Dee và cs, 2005 [20] nếu sử dụng giầy dép một lần, găng tay, các dụng cụ hai lớp và ngâm chân vào hố sát trùng trước khi vào trại có thể làm

giảm tối ña mức ñộ vấy nhiễm PRRSV trên bề mặt của các vật dụng này và hạn chế lây lan PRRSV theo phương thức cơ học

Cũng theo Dee và cs, 2005 [20] các phương tiện vận chuyển gần ñây

ñã ñược khảo sát là một trong những ñường lây lan PRRSV theo phương thức cơ học

Nghiên cứu của Otake, 2002 [34] cho rằng các loài côn trùng, muỗi – Aedes vexans và ruồi nhà - Musca domestica tiếp xúc thường xuyên với các phương tiện, dụng cụ, thiết bị dùng cho chăn nuôi lợn là một trong những nhân tố cơ học mang PRRSV từ lợn nhiễm bệnh sang lợn mẫn cảm

Wills R W và cs, 1997 [44] thông báo, các loài ñộng vật có vú: Loài gặm nhấm, gấu trúc Mỹ, chó, mèo, thú có túi, chồn hôi và các loài chim (chim

sẻ, sáo nuôi) có vai trò quan trọng trong việc làm lây lan PRRSV Không có loài nào là vector sinh học

Zimmerman và cs, 1997 [43] ñã gây bệnh qua ñường miệng cho gà, ngan, gà lôi với khoảng 104 TCID50 PRRSV Không thấy xuất hiện triệu chứng lâm sàng ở bất cứ loài chim nào và chúng không có sự thay ñổi phản ứng huyết thanh ñối với PRRSV Tuy nhiên có thể phân lập ñược PRRSV sau khi gây nhiễm 5 ngày trong phân gà, 5-12 ngày trong phân gà lôi

Theo Zimmerman và cs, 1997 [43] các loài thuỷ cầm di trú (vịt trời) là một trong những vector làm lây lan PRRSV trong các trang trại Ông và các

cs ñã phân lập ñược virut này trong phân của vịt trời Theo Dee và cs, ñó là do bản năng di trú của chúng và khuynh hướng làm tổ ở các ñầm phá gần các trại lợn Và vì PRRSV có thể sống sót trong nước ñến 11 ngày và trong mương chứa chất thải của lợn tới 7 ngày ðây có thể là giả thuyết ñáng tin cậy, tuy nhiên hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi về vấn ñề này

Một số nghiên cứu khác ñã cho thấy rằng lợn gây bệnh thực nghiệm có thể lây nhiễm cho lợn chỉ báo qua không khí ở khoảng cách 1m Theo

sống có thể lây lan tới 105 m qua sử dụng mô hình ống thẳng áp lực âm, dẫn tới lây nhiễm lợn chỉ báo mẫn cảm

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn ựã ựược phát hiện từ năm 1997 khi nhập 51 lợn giống từ Mỹ Bằng phản ứng huyết thanh học ựã xác ựịnh ựược 10 trong số 51 lợn giống trên có phản ứng dương tắnh với PRRSV

Trong các năm 2003-2005, Trần Thị Bắch Liên và Trần Thị Dân, 2003[11] bằng kỹ thuật ELISA, khảo sát 1082 mẫu huyết thanh của lợn thu nhận từ 21 trại nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của các tỉnh thành thuộc miền đông Nam Bộ cho thấy:

- 85,71% số cơ sở chăn nuôi phát hiện có lợn nhiễm PRRSV và 36,78% số mẫu huyết thanh dương tắnh

- Lợn hậu bị và lợn thịt lúc giết mổ có tỉ lệ nhiễm cao nhất: 51,24% và 49,25%

- Khu vực chăn nuôi tập trung có tỷ lệ nhiễm (56,72%) cao hơn so với khu vực chăn nuôi gia ựình (29,98%)

- Trong 130 mẫu huyết thanh dương tắnh có 59,23% số mẫu nhiễm chủng Bắc Mỹ, 36,92% số mẫu nhiễm cả hai chủng Bắc Mỹ và Châu Âu, chỉ

có 3,8% số mẫu nhiễm chủng Châu Âu

Nguyễn Lương Hiển và cs, 2001 [5] ựiều tra tình hình Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở ựàn lợn nuôi trên ựịa bàn Thành phố Hồ Chắ Minh

và các tỉnh lân cận cho thấy trong số 2036 mẫu huyết thanh của lợn ựược kiểm tra có 596 mẫu huyết thanh có kháng kháng thể PRRSV, chiếm tỷ lệ 29,27%; 5 trong số 15 trại lợn ựược lấy mẫu xét nghiệm có lợn bị nhiễm PRRSV, chiếm tỷ lệ 33%

Tại Cần Thơ, kết quả xét nghiệm của La Tấn Cường, 2005 [7] cho biết

tỷ lệ nhiễm PRRSV của ñàn lợn nuôi trên ñịa bàn là 66,86%

ðiều tra huyết thanh học của Kamakawa và Hồ Thị Việt Thu từ 1999 -

2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV của ñàn lợn trên ñịa bàn tỉnh Cần Thơ là 7,7% Thông báo của Cục thú y, 2007 [2]: Các kết quả ñiều tra huyết thanh học tại một số trại lợn giống của các tỉnh phía Nam ñã phát hiện có sự lưu hành của PRRSV chủng cổ ñiển, ñộc lực thấp, gây bệnh với mức ñộ nhất ñịnh

Kết quả khảo sát bước ñầu của Lê Văn Năm về tình hình Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn trong ñợt dịch 2007 tại một số xã thuộc vùng ñồng bằng Bắc Bộ: Tỷ lệ lợn ốm, ñối với lợn nái nuôi con là 74,86%; nái hậu

bị và nái chửa là 74,07%; lợn con theo mẹ là 89,10%; lợn choai là 80,07%; lợn ñực giống là 47,57%

Lợn con bị bệnh, tỷ lệ bị tiêu chảy khá cao (83,25%); lợn ốm bị táo bón 50,50%; lợn con bị lạc giọng 60,50%

1.2 Virus PRRS

1.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS

Virus PRRS là một virus ARN chuỗi ñơn, virus ñược xếp vào giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Quan sát virus PRRS dưới kính hiển vi ñiện tử thấy virus có dạng hình cầu có vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45 - 80 nm và chứa nhân nucleocapxit kích thước 25 - 35 nm

Hình 1.2 Hình thái Virus PRRS

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợp AND là 5 - bromo - 2 deoxyuridin, 5 - iodo - 2 deoxyuridin và mitomicin C chứng tỏ acid nucleic ñó là ARN Sợi ARN này có khối lượng khoảng 15.1 kb

Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Virus PRRSV có các loại Protein cấu trúc bao gồm:

- Nuclecapsid Protein (N, ORF7) (ORF: open reading frame) khoảng

14 -15 kDa, ñây là Protein vỏ bọc nhân

- Membrane Protein (M, ORF6) khoảng 18 - 19 kDa là Protein liên kết vỏ bọc

- Envenlope Glycoprotein (E, ORF5) từ 24 - 25 kDa là Protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen

Ngoài ra còn có 3 loại Glycoprotein cấu trúc ít thấy hơn và ñược ký hiệu là ORF 2, 3 và 4

1.2.2 Phân loại virus PRRS

Về tính ña dạng di truyền, virus PRRS có hai chủng chính: Chủng virus

có nguồn gốc ở Châu Âu (virus Lelystad - LV) và chủng virus có nguồn gốc ở Bắc Mỹ (VR - 2332) Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta ñã chứng minh ñược có sự biến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập Theo Murtaugh và cs (1995) [28], Nelsen và cs (1999) [29], Meng và cs (1995) [26] các chủng virus này gây bệnh trên ñộng vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau nhưng chúng lại ñại diện cho 2 genotyp khác biệt

Những nghiên cứu gần ñây cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus ñược phân lập từ các vùng ñịa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay ñổi về chuỗi nucleotid khá cao ñến 20% Chủng Bắc Mỹ có 3 subtyp: VR - 2332, Taiwan và 807/94 phân lập

ở Canada Chủng Châu Âu có 2 subtyp: I 10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha Chính sự khác biệt và sự ña dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến ñổi cấu trúc kháng nguyên của virus ñã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng

Người ta ñã phát hiện thấy chủng virus Châu Âu tại một số vùng của Bắc Mỹ Ở Châu Á, PRRSV ñã trở nên khá phổ biến với sự có mặt của cả hai

chủng Châu Âu và Bắc Mỹ, sự phân bố virus theo các vùng ựịa lý chỉ là tương ựối Các virus PRRS ựược phân lập ở Châu Âu có cùng loại kháng nguyên nhưng khác biệt với các chủng của Bắc Mỹ

1.2.3 Sức ựề kháng của virus PRRS

PRRSV là một loại virus có vỏ bọc bên ngoài, sự sống sót của PRRSV bên ngoài vật chủ chịu tác ựộng của nhiệt ựộ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng

PRRSV có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở nhiệt ựộ dao ựộng trong khoảng - 70ỨC ựến - 20ỨC, 20 phút ở 56ỨC, 24 giờ ở 30ỨC và 6 ngày ở nhiệt ựộ 21ỨC (Benfield và cs, 1992), [16] Tuy nhiên khả năng sống sót của virus PRRS giảm nhanh khi nhiệt ựộ tăng lên

PRRSV bền vững ở pH dao ựộng trong khoảng 6,5 ựến 7,5 Tuy nhiên tắnh gây nhiễm giảm ở pH < 6,0 hoặc > 7,65 (Paton và cs, 1991) [35]

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

1.3 Dịch tễ học của bệnh

1.3.1 động vật cảm nhiễm

Mọi giống lợn ở các lứa tuổi ựều cảm nhiễm với PRRSV Các cơ sở chăn nuôi công nghiệp với quy mô lớn, bệnh thường lây lan nhanh, tồn tại lâu dài trong ựàn nái, rất khó thanh toán Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai (Lê Văn Năm, 2007 [8], đào Trọng đạt, 2008 [3])

Theo tổ chức Nông lương thế giới (FAO), PRRSV không lây truyền và gây bệnh cho người và các ựộng vật khác Tuy nhiên, một số loại thuỷ cầm như vịt trời (Mallard duck) ựã ựược chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này đây chắnh là nguồn phát tán virus ra diện rộng, khó khống chế

1.3.2 Phương thức lây truyền

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn ñực giống cũng ñược xác ñịnh là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm sang bào thai Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ giai ñoạn giữa thai kỳ trở ñi và virus cũng ñược bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày trong khi ñó lợn con và lợn choai bài thải virus tới 1 - 2 tháng

Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: Vận chuyển lợn mang trùng, phân tán theo gió (có thể ñi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng

cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao ñộng nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một số chim hoang dã

Sự lây truyền qua không khí là quan trọng trong việc phát tán virus PRRS

Sự lây lan bệnh từ ñàn lợn này sang ñàn lợn khác thường theo tinh dịch khi phối giống Ngoài ra còn các ñường khác như kim tiêm, nước uống, không khí, côn trùng, vật liệu nhiễm khuẩn, ký chủ không phải là lợn Ở Pháp 56% ñàn mắc bệnh do tiếp xúc với lợn bệnh, 20% do tinh dịch, 21% do vật dụng và 3% từ những nguồn chưa xác ñịnh ñược

Zimerman và cs (1997) [48] ñã gây bệnh qua ñường miệng cho vịt trời, ngan, gà lôi với khoảng 104 TCID50/ml virus PRRS Qua thí nghiệm có khả năng phân lập virus ở phân gà 5 ngày sau khi gây bệnh, gà lôi 5 ngày và 12 ngày, vịt trời khoảng 5 ngày Trong các thí nghiệm này triệu chứng lâm sàng không thấy ở bất cứ loài chim nào và chúng không có sự thay ñổi phản ứng huyết thanh ñối với virus PRRS Nhưng có những nghiên cứu chứng minh rằng chim di trú (như vịt trời) có thể bị nhiễm, bởi vậy chúng có khả năng truyền virus ñi xa

Ở các cơ sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm nhưng tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống và bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản trong khi lợn con bị viêm ñường hô hấp phổ biến

Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua không khí ñược coi như

là phương tiện truyền lây phổ biến nhất

1.3.3 Cơ chế sinh bệnh

Virus có ñặc ñiểm rất thích hợp với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào phế nang ðây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này

và phá hủy nó Virus nhân lên ngay bên trong ñại thực bào, sau ñó phá hủy và giết chết ñại thực bào (tới 40%) ðại thực bào bị giết chết nên sức ñề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng

bị nhiễm khuẩn kế phát

Có nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát ở ñàn lợn trong ổ dịch PRRS, ñặc biệt ở chuồng nuôi lợn sơ sinh Tác nhân chủ yếu liên quan ñến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus pleuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky), Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus

Các nhà nghiên cứu ñã phân lập virus từ phổi, gan, lách và huyết thanh hoặc dịch cơ thể lợn con sinh ra cả sống và chết nhưng không phân lập ñược

từ thai chết khô, họ cũng phát hiện kháng thể chống PRRSV ñặc hiệu trong dịch xoang ngực hoặc sữa ñầu Dấu hiệu này chỉ ra rằng truyền bệnh qua nhau thai là phổ biến trong giai ñoạn cuối kỳ chửa, nhưng cơ chế của giảm sinh sản còn chưa ñược hiểu biết

Lợn nái cĩ virus trong huyết thanh sớm lúc 1 ngày sau khi tiêm truyền,

cĩ thể đốn là sau đĩ virus nhân lên ở đại thực bào phế nang Virus huyết kéo dài (lên tới 14 ngày) là điển hình ở lợn nái; vì vậy chúng cĩ đủ thời gian để tuần hồn máu, đưa virus tới nhau thai Virus vượt qua nhau thai và nhiễm vào thai như thế nào? Terpstra và cs (1991) [38] gợi ý rằng đại thực bào cĩ thể đi qua nhau thai, nhưng câu hỏi cần thiết đưa ra liệu virus cĩ liên quan đến đại thực bào cĩ trong máu hay khơng cịn chưa biết rõ Chistianson và cs, (1992) [18] đã tiêm virus vào trong tử cung cĩ thai 45 - 49 ngày tuổi đã chứng minh rằng ở giai đoạn giữa thời kỳ mang thai giúp virus nhân lên nhưng chúng ít khi vượt qua nhau thai ở giai đoạn này

Người ta đã phân lập virus từ đại thực bào phế nang, phổi, tim, thận, não, lách, hạch lâm ba, tuyến ức, amidan, tủy xương, bạch cầu mạch máu ngoại vi và huyết thanh Virus huyết cĩ thể phát hiện ngay 1 ngày sau khi tiêm truyền, tuy nhiên 28 ngày phổ biến hơn Cịn chưa biết rõ rằng liệu các

cơ quan trên cĩ phải là nơi nhân lên của virus hay khơng hay chỉ đơn thuần do kết quả của dịng máu đưa vào các mơ

1.4 Triệu chứng của lợn mắc PRRS

Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của hội chứng PRRS, các nhà khoa học ñã cho rằng: Triệu chứng lâm sàng của lợn rất khác nhau phụ thuộc vào các chủng virus, trạng thái miễn dịch của ñàn cũng như ñiều kiện quản lý chăm sóc

1.4.1 Lợn nái

Trong tháng ñầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 40ºC - 41ºC, một số con tai chuyển màu xanh trong thời gian ngắn, tím ñuôi, tím âm hộ, sảy thai ở giai ñoạn ñầu Lợn nái trong giai ñoạn nuôi con thường biếng ăn, lười uống nước, viêm vú, mất sữa, ñộng dục lẫn lộn 5 - 10 ngày sau khi sinh, nái chậm lên giống Nếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn ñến

tử vong ðỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, ñẻ non, thai chết lưu, thai

gỗ hàng loạt Lợn con ñẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%

1.4.2 Lợn ñực giống

Khi bị nhiễm bệnh, lợn thường bỏ ăn, sốt cao, ñờ ñẫn hoặc hôn mê, một

số con có hiện tượng tai chuyển màu xanh ðặc biệt xuất hiện hiện tượng viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính ñực, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém Lợn ñực giống rất lâu mới hồi phục ñược khả năng sinh sản

1.4.3 Lợn con theo mẹ

Hầu như lợn con sinh ra chết sau vài giờ Số con sống sót tiếp tục chết vào tuần thứ nhất sau khi sinh, một số tiếp tục sống ñến lúc cai sữa nhưng có triệu chứng khó thở và tiêu chảy

Thể trạng gầy yếu, lợn nhanh chóng rơi vào tình trạng tụt ñường huyết

do không bú ñược, mắt có dử màu nâu, sưng mí mắt và các màng quanh mắt, trên da xuất hiện những ñám phồng rộp, tiêu chảy, chân choãi ra, ñi run rẩy, lợn con rất dễ mắc các bệnh kế phát và tỷ lệ tử vong cao

1.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ, thuỷ thũng mí mắt, tai xanh tím, rối loạn hô hấp, tiêu chảy phân màu nâu ñỏ hoặc xám Tỷ lệ chết khoảng 15% do viêm phổi và bội nhiễm vi khuẩn kế phát

1.5 Bệnh tích của lợn mắc PRRS

1.5.1 Lợn nái mang thai

Trường hợp ñẻ non thì thấy nhiều thai ñã chết, trên cơ thể chúng có nhiều ñám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp ñẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn so với ñẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc ñẻ

do thời gian ñẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử

và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

1.5.2 Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thùy ñỉnh, xong cũng thấy ở các thùy khác nhưng hầu như không xuất hiện ñối xứng Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám ñỏ, rắn chắc Mô phổi lồi ra và có màu ñỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như ñá grannito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy phổi chìm, chứng tỏ phổi ñã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách của lợn mắc PRRSV có bệnh tích không ñặc trưng tùy thuộc vào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng ở những lợn tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt có phủ một lớp nhầy màu nâu

1.5.3 Lợn con theo mẹ

Thể xác gầy, ướt Các biến ñổi ở phổi giống như các loại lợn khác Ruột chứa nhiều nước, thành ruột mỏng và ñôi khi thấy có một số cục sữa vón không tiêu

1.6 Các phương pháp chẩn đốn PRRS

1.6.1 Chẩn đốn lâm sàng

Dựa vào triệu chứng lâm sàng theo Anette (1997) [14]: Viêm phổi ở lợn con và lợn vỗ béo, triệu chứng đường sinh sản Tuy nhiên bệnh cĩ thể khơng điển hình theo lứa tuổi vì vậy trong chẩn đốn lâm sàng cần phân biệt bệnh PRRS với các bệnh: Viêm não Nhật Bản, bệnh giả dại, cúm lợn, viêm màng phổi, suyễn, bệnh do Toxoplasma (Lê Văn Năm, 2007) [8]

1.6.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh

ðối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và cĩ vùng xám và hồng

Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho…

1.6.3 Chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học

ðể phát hiện sự cĩ mặt của virus PRRSV người ta cĩ thể sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào một lớp và phản ứng trung hịa virus trên mơi trường

tế bào một lớp (VNT); phương pháp miễn dịch bệnh lý khi sử dụng kháng thể chuẩn để phát hiện virus cĩ trong mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS (Bưtner và

cs, 2000) [13]; (Anette, 1997) [14]

Phương pháp ELISA cĩ thể chuẩn đốn một số lượng mẫu huyết thanh lớn và kết quả nhanh Khi dùng phương pháp này cĩ thể phát hiện được cả chủng virus cĩ nguồn gốc Bắc Mỹ và chủng cĩ nguồn gốc từ Châu Âu

Phản ứng trung hịa virus trên mơi trường tế bào một lớp (Virus neutralization test) là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hịa cĩ thể tồn tại ít nhất một năm (Anette, 1997) [14]

Tuy nhiên phản ứng trung hòa virus kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác vì kháng thể trung hòa xuất hiện chậm hơn

Có một thực tế là khi ñánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh phải cân nhắc ñến trạng thái miễn dịch của ñàn sau khi ñược tiêm phòng vacxin vì hiện tại chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt ñược kháng thể do lợn mắc bệnh tự nhiên hay do tiêm phòng vacxin (Anette, 1997) [14]

1.6.4 Kỹ thuật RT - PCR

Dùng phản ứng RT - PCR phân tích mẫu máu (ñược lấy trong giai ñoạn ñầu của pha cấp tính) ñể xác ñịnh sự có mặt của virus, ñây là phản ứng tương ñối nhạy và chính xác

Kỹ thuật RT – PCR hay còn gọi là phản ứng PCR ngược là một phản ứng nhân một ñoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR bao gồm hai giai ñoạn: Giai ñoạn thứ nhất là chuyển ñổi một sợi RNA làm khuôn thành cDNA, sau ñó qua giai ñoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn ñể tiếp tục thực hiện phản ứng PCR

Hình 1.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ñó có Adenine, Guanine, Cystein, Uracil Chuỗi nucleotit này phải ñược chuyển ñổi thành DNA hai sợi mà thành phần Uracil ñược thay thế bằng Thyamine Phản

ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ ñến vai trò của enzyme phiên mã ngược

Do vậy giai ñoạn này ñược gọi là giai ñoạn chuyển ngược Khi ñã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR Toàn bộ phản ứng nhân một ñoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai ñoạn nói trên ñược gọi là phản ứng RT- PCR hay phản ứng PCR ngược Thay ñổi nhiệt ñộ ñể phù hợp cho mỗi chu kỳ (Lê Thanh Hoà, 2006)

Có thể phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch amidan…Tuy nhiên virus PRRS có ñặc ñiểm khó phân lập và khó quan sát bệnh tích tế bào… Virus thích hợp nhất trên tế bào ñại thực bào ở phổi lợn, tuy nhiên mỗi lần phân lập ñều phải sản xuất lại tế bào, giữa các lô tế bào ñược sản xuất ra

có sự biến ñổi khác nhau và ñộ mẫn cảm với virus PRRS cũng khác nhau Trong phòng thí nghiệm PRRS thích ứng trên các loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc-145…trong ñó tế bào thận khỉ Châu Phi Marc-145 thường ñược

sử dụng nhiều nhất (Anette, 1997) [14]

CHƯƠNG II ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu:

+ Lợn con theo mẹ + Lợn con sau cai sữa + Lợn choai

+ Lợn nái mang thai + Lợn nái nuôi con

- ðịa ñiểm nghiên cứu : Khu vực Phúc Sơn và Hạnh Sơn huyện Văn Chấn Phòng Thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ sinh học Thú y, khoa Thú y,

ðH Nông nghiệp Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác ñịnh triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc bệnh PRRS

- Nghiên cứu bệnh tích ñại thể của lợn mắc PRRS

- Nghiên cứu bệnh tích vi thể của lợn mắc PRRS

kháng kháng thể PRRS, kháng thể tương ứng chuẩn đốn PRRS, muối NaHCOɜ, kit RT-PCR, hĩa chất cho tách chiết RNA của virus

2.3.3 Dụng cụ

- Tủ lạnh, tủ ấm 37ºC, tủ sấy, buồng cấy vơ trùng

- Máy đúc tự động, máy cắt Microton, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện li, máy chụp ảnh gel

- Các dụng cụ khác gồm: Lam kính, kính hiển vi, ống eppendoft, pipet, găng tay…

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp quan sát

ðể xác định được triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tơi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên ðồng thời dựa vào các đặc điểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thơng tin liên quan Tiến hành phân tích, thống kê để đưa ra những kết quả chính xác Xác định chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu cĩ ý nghĩa vơ cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

2.4.2 Phương pháp mổ khám

ðể xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn cĩ biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng và quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá lách… ngâm trong fomol 10% làm tiêu bản vi thể

2.4.3 Phương pháp làm tiêu bản kiểm tra bệnh tích vi thể

Từ những mẫu bệnh phẩm cĩ các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu

bản vi thể theo quy trình tẩm ñúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

- Khử formol

+ Mục ñích ñể rửa sạch formol

+ Sau khi cố ñịnh bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7 – 10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có ñộ dài 4-5 mm Sau ñó ñem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ

+ Xylen II: 4 giờ

+ Xylen III: 12 giờ

- Khử xylen

Cho qua hệ thống 3 cốc ñựng paraffin

+ Paraffin I: 6 giờ (Ở 560C)

+ Paraffin II: 6 giờ (Ở 560C)

+ Paraffin III 12 giờ (Ở 560C)

+ Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn và gắn nhãn tránh nhầm lẫn

- Cắt tiêu bản

Cắt và dán mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với ñộ dày 2 - 3µm Miếng tổ chức sau khi cắt ra sẽ ñược tãi phẳng trên phiến kính nhờ cho vào bình nước ấm Chờ cho miếng tổ chức khô cho vào tủ ấm 370C trong 12 - 24 giờ

- Nhuộm tiêu bản

Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxylin-Eosin Các bước nhuộm như sau:

+ Tẩy paraffin: Cho qua hệ thống 3 lọ xylen

Xylen I: 1h, Xylen II: 1h, Xylen III: 1h

Sau ñó phải lau hết phần xylen quanh tiêu bản rồi chuyển sang cồn + Tẩy Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm hai lọ cồn ethylic

ñậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây

+ Nhuộm Eosin:

Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 10 phút tùy theo thực tế màu eosin Sau ñó rửa nước chảy 10 phút cho hết eosin thừa Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm rồi cho vào nước cất ở lam kính

+ Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống

Cồn 900I: 15 giây

Cồn 1000I: 15 giây

Cồn 1000II: 15 giây

+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua xylen I Rồi sang xylen II,

ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kính rối chuyển sang xylen III rồi sang xylen

IV, sau ñó cho vào xylen ñã làm nóng trong tủ ấm 370 trong vòng 2 phút

2.4.4 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC)

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm ñúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể

Các bước nhuộm

Bước 1: Làm sạch tiêu bản

Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất

Bước 2: Hoạt hóa enzym

Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 121ºC/5 phút Bước 3: Khử peroxydase nội sinh

Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1 H2O2 30%: 9 Methanol Ngâm tiêu bản trong 10 phút)

Bước 4: Gắn kháng thể (KT)

Nhỏ 80µ1 KT PRRS/ tiêu bản

ðể tủ ấm 37ºC 1 giờ hoặc 4ºC/ qua ñêm

Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần)

Bước 5: Gắn kháng kháng thể

Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/ tiêu bản

ðể tủ ấm 37ºC/1h

Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần)

Bước 6: Cho cơ chất

Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 - 8 phút

Kiểm tra dưới kính hiển vi thường: Nếu nhìn thấy màu thì rửa tiêu bản qua nước; nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB ñến khi nhìn thấy màu Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Haematoxylin (30s), làm sạch, gắn Baume canada lên lamen nhanh trên tiêu bản và quan sát bằng kính hiển vi quang học

2.4.5 Phương pháp RT-PCR

a) Chiết tách RNA

RNA của virus ñược tách chiết bằng Kit, quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước cụ thể như sau:

Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer (AVL +AVE-carier RNA ñể dùng cho kit)

(5.6 ml AVL + 56 µl AVE- carier RNA cho 10 mẫu)

Bước 1: cho 560 µl buffer vào ống eppendorff

Bước 2: Thêm 140 µl mẫu cần tách chiết

Votex 15 giây

Bước 3: ly tâm ngắn

Bước 4: Ủ nhiệt ñộ phòng 10 phút

Bước 5: Thêm 560 µl cồn 96 - 1000

Votex 15 giây

Spin down loại bỏ các giọt trên nắp

Bước 6: Hút 630 µl từ ống eppendorff vào cột QIA

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bỏ dịch trong phía dưới

Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại

Bước 8: Thêm 500 µl AW1

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bỏ dịch trong phía dưới

Bước 9: Thêm 500 µl AW2

Ly tâm14.000 vòng/phút trong 3 phút

Bỏ dịch trong phía dưới

Bước 10: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Loại bỏ hoàn toàn AW2

Bước 11: ðặt cột QIA sang ống eppendorff sạch

Thêm 60 µl AVE

Ủ nhiệt ñộ phòng 1 phút

Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút

Bước 12: Lặp lại bước 11 (nếu cần)

Thêm 30 µl AVE vào cột QIA

Ủ nhiệt ñộ phòng 1 phút

Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Thu ñược 60 µl dịch chiết RNA, bảo quản ở nhiệt ñộ -200C

b) Tiến hành phản ứng RT- PCR

Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ñược hỗn hợp với các thành phần ñược trình bày ở bảng sau:

Với trình tự mồi như sau:

Primer Forwad: GAG ACC ATG AGG TGG GCA AC

Primer Reverse: CGC CAA AAG CAC CTT TTG T

Tiến hành phản ứng khuếch ñại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:

Giai ñoạn Bước tổng hợp Nhiệt ñộ ( o C) Thời gian Chu kỳ

c) ðiện di kiểm tra sản phẩm PCR

- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, ñun sôi trong lò vi sóng, ñể nguội ñến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 ul Syber green, ñổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ñiện di

- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT-PCR

- Chuẩn bị bể ñiện di: Chuyển thạch ñã ñông vào bể ñiện di, thêm TBE 1X ñến ngập thạch

- Nhỏ marker và sản phẩm PCR ñã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl maker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng

- ðiện di ở hiệu ñiện thế 100V trong 30 phút

- Quan sát kết quả ñiện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khái quát về ựiều kiện Tự nhiên - Kinh tế - Xã hội huyện Văn Chấn

Văn Chấn là một huyện miền núi nằm ở phắa tây của tỉnh Yên Bái có vị trắ ựịa lý từ 21020' - 21045' vĩ ựộ bắc, 104020' - 104023' ựộ kinh ựông, tiếp giáp với các ựịa phương: Phắa Bắc giáp huyện Mù Cang Chải; Phắa Nam giáp tỉnh Sơn La và Phú Thọ; Phắa đông giáp huyện Văn Yên và Trấn Yên; Phắa tây giáp huyện Trạm Tấu

Tổng diện tắch tự nhiên toàn huyện là 120.758,5ha tương ựương với 1.207,585 Km2 chiếm 17,5% diện tắch toàn Tỉnh và là huyện có diện tắch lớn thứ 2 trong tỉnh Huyện Văn Chấn có 31 ựơn vị hành chắnh (3 thị trấn và 28 xã); trong ựó có 16 xã ựặc biệt khó khăn và 28 thôn bản của xã vùng II thuộc diện ựặc biệt khó khăn

Huyện lỵ cách thành phố Yên Bái trung tâm Chắnh trị - Kinh tế - Văn hoá của tỉnh 72 Km, cách thị xã Nghĩa Lộ 10 Km, cách Thủ ựô Hà Nội hơn

200 Km, có ựường quốc lộ 32 chạy dọc theo chiều dài của huyện, có các tuyến ựường thông thương với các huyện trong tỉnh là Trạm Tấu, Mù Cang Chải, Trấn Yên và các tỉnh bạn như Sơn La, Phú Thọ, Lai Châu tạo cho Văn Chấn có một hệ thống ựường bộ thuận tiện giao lưu với các huyện bạn trong tỉnh và các tỉnh bạn Bên cạnh những thế mạnh trong phát triển kinh tế, Văn Chấn còn có vị trắ chiến lược quan trọng trong khu vực phòng thủ và hệ thống quốc phòng của tỉnh, của khu vực Tây Bắc

Văn Chấn có ựịa hình phức tạp, có nhiều núi cao và suối lớn chia cắt

độ cao trung bình so với mặt nước biển 400 m Huyện ựược chia thành 3 vùng lớn: Vùng trong (Vùng Mường Lò), vùng Ngoài và vùng cao thượng

huyện