Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút viêm não Nhật Bản, xác định vai trò gây bệnh của vi rút viêm não Nhật Bản genotyp 1

Kỹ thuật sinh học phân tử như RT-PCR, Sequencing giải trình tự gen...Các phần mềm sinh học được ứng dụng phân tích kết quả của các kỹ thuật giải trình tự gen, so sánh cặp và sắp xếp đa t

CỦA VIRUS VNNB GENOTYP 1

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: pgs.TS Phan Thị Ngà

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện vệ sinh dịch tễ trung −ơng

7502

03/9/2009

HÀ NỘI - 2008

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS VIÊM NÃO

NHẬT BẢN (VNNB), XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY BỆNH CỦA VIRUS VNNB GENOTYP 1

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS PHAN THỊ NGÀ

Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài: Nghiên cúu dịch tễ học phân tử virus viêm não Nhật Bản (VNNB), xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS TS PHAN THỊ NGÀ

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế

5 Thư ký đề tài: CN Nguyễn Viết Hoàng

6 Phó chủ nhiệm đề tài hoặc ban chủ nhiệm đề tài (nếu có):

7 Danh sách những người thực hiện chính:

- PGS TS Phan Thị Ngà

- BS Đỗ Phương Loan

- CN Nguyễn Việt Hoàng

- KS Bùi Minh Trang

- KTV Lê Thị Hiền Thu

- Ths Tống Thị Hà

- Ths Hoàng Minh Đức

- TS Nguyễn Thị Thuỳ Dương

- BS Nguyễn Văn Hoà

- BS Hoàng Anh Vường

- TS Vũ Thị Quế Hương

- Ths Huỳnh Thị Kim Loan

Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương Quân Y viện 108

Viện Vệ Sinh Dịch tễ Tây Nguyên Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

8 Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài (nếu có):

Complement DNA (ADN bổ trợ) Enzym Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch enzym)

Eagle Minimum Essential Medium Envelope (vỏ bao)

Kilodalton Non-structural protein - protein không cấu trúc Plaque forming unit (đơn vị tạo đám hoại tử = 1 virus) Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi sao chép ngược)

MỤC LỤC

PHẦN A: Báo cáo tóm tắt

1 Tóm tắt kết quả nghiên cứu

2 Bản tự đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài

PHẦN B: Báo cáo chi tiết

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài

1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan tới đề tài

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

Chương 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết kế nghiên cứu

3.2 Chọn mẫu, đối tượng nghiên cứu

3.3 Phương pháp nghiên cứu:

Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 5 BÀN LUẬN

Chương 6 KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC: - Bảng xác nhận chi tiêu tài chính

- Minh chứng đào tạo (văn bằng tốt nghiệp đại học)

- Minh chứng về kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen E

của một số chủng virus VNNB genotyp 1

- Minh chứng về các bài báo khoa học liên quan đến đề tài

80

82

PHẦN A BÁO CÁO TÓM TẮT

1 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1.1 Mục đích nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu thực hiện nhằm đạt được các mục đích sau:

- Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam

- Xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử và mô hình thực nghiệm trên động vật cảm thụ

1.2 Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Để đạt được mục đích nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật phân lập virus VNNB từ muỗi, lợn, người Kỹ thuật sinh học phân tử như RT-PCR, Sequencing (giải trình tự gen) Các phần mềm sinh học được ứng dụng phân tích kết quả của các kỹ thuật giải trình tự gen, so sánh cặp và sắp xếp đa trình tự, phân tích sự biến đổi của trình tự acid amine của vùng gen E; xây dựng cây phát sinh loài và phần mềm xây dựng bản đồ dịch tễ học các genotyp virus VNNB ở Việt Nam trong các năm 1988 – 2007 để chỉ

ra mối liên quan giữa các genotyp của virus VNNB

Cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu là 34 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, từ muỗi, lợn trong các năm 1988 - 2007

1.3 Các tiêu chí đánh giá kết quả nghiên cứu

Đánh giá kết quả nghiên cứu của đề tài dựa trên các tiêu chí sau:

- Phân lập được các chủng virus VNNB từ mẫu bệnh phẩm của bệnh

nhân có hội chứng não cấp bằng tế bào Aedes albopictus dòng C6/36 Kết quả định loại virus VNNB được xác định bằng kỹ thuật ELISA Sandwich;

- Các chủng virus VNNB được khuếch đại vùng gen E bằng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp Sản phẩm của kỹ thuật PCR được sử dụng để tinh sạch, làm khuôn để tổng hợp các đoạn PCR cho giải trình từ gen bằng các mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế trong vùng gen E đặc hiệu với virus VNNB

để xác định toàn bộ trình tự vùng gen E dài 1500 nucleotide

- Xác định đặc điểm di truyền của virus VNNB qua kết quả giải trình

tự gen và phân tích đoạn gen E (Envelope), trên cơ sở đó xây dựng cây phát sinh loài của virus VNNB, vẽ bản đồ dịch tễ về sự phân bố virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 ở Việt Nam;

- Khẳng định virus VNNB genotyp 1 có khả năng gây bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử và thực nghiệm trên động vật cảm nhiễm

1.4 Vật liêu và phương pháp

1.4.1 Vật liệu

Trong nghiên cứu này, sinh phẩm và trang thiết bị cần thiết cho nghiên cứu được cung cấp đầy đủ Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu được thực hiện theo quy trình chuẩn thức của phòng thí nghiệm và theo hướng dẫn của nhà sản xuất sinh phẩm

1.4.2 Phương pháp

Phần mềm tin sinh học DNA Star-Lasegene (Madison, Wisconsin, USA) và MEGA 4.0 (USA) được ứng dụng để nghiên cứu, đánh giá và phân tích các đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử các chủng virus VNNB Trình

từ vùng gen E dài 1500 nucleotide của các chủng virus thực hiện trong nghiên cứu này và các chủng là đại diện cho các genotyp khác được lấy trong ngân hàng gen được so sánh cặp và sắp xếp đa trình tự theo chương trình ClustalW Cây phát sinh loài được vẽ bằng phương pháp Neibour-Joining (Saito&Nei 1987) với giá trị để tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tin

cậy) tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần Chọn giá trị ngưỡng là 12 % khác nhau về số nucleotide để phân chia các genotyp virus VNNB Cây phát sinh loài là cơ sở để xác định mối quan hệ về mặt di truyền của các chủng virus VNNB Tính tương đồng và không tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng virus VNNB được tính bằng phần mềm DNAStar-Lasegene

Phần mềm vẽ bản đồ HealthMap 8.1 được sử dụng để xây dựng bản

đồ về sự lưu hành các genotyp virus VNNB khác nhau ở mức độ địa giới hành chính phân chia cấp độ tỉnh Ngoài ra, có sử dụng các thuật toán thống

kê sử dụng trong nghiên cứu: Excel, SPSS; các thuật toán thống kê sinh học chuyên sâu sử dụng trong nghiên cứu UPGMA, Neibour-Joining

1.5 Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xác định:

- Dịch tễ phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam dựa trên kết quả giải trình tự và phân tích vùng gen E của 34 chủng virus VNNB phân lập trong các năm 1988 – 2007 đã khẳng định: Virus VNNB genotyp 1 lưu hành ở cả bốn miền Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên từ các mẫu phân lập virus có nguồn gốc là muỗi, lợn trong các năm 2001 – 2007; xác định có

sự lưu hành đồng thời cả virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 ở Việt Nam trong các năm từ năm 1990 cho đến 2007

- Vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 được khẳng định bằng

kỹ thuật sinh học phân tử với 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân trong các năm 1988 – 2007: (1) Kết quả xác định có 1 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ký hiệu 90VN70 được xác định thuộc genotyp 1, chiếm tỷ lệ rất thấp 1/27 (3,7 %); có 26 chủng phân lập từ bệnh nhân thuộc genotyp 3, chiếm tỷ lệ rất cao trong số các chủng phân lập từ người 26/27 (96,3 %) Trên động vật cảm thụ (chuột Swiss trằng), chủng virus 90VN70

gây ốm, liệt chuột ổ và chuột 11 – 13 gam sau 3 - 4 ngày gây nhiêm, khẳng định độc lực và tính hướng thần kinh của virus VNNB genotyp 1

1.6 Các kết quả khác liên quan với khoa học, kỹ thuật và kinh tế

- Đã đào tạo được 01 cử nhân sinh học có nghiên cứu liên quan đến đề tài

- Có năm bài báo liên quan đến đề tài đã được công bố trên tạp chí quốc gia

và quốc tế

- Tham dự ba hội nghị khoa học trong nước và quốc tế

- Đăng ký trình tự vùng gen E của một số chủng vi rút VNNB genotyp 1 và genotyp 3 trên ngân hàng gen quốc tế

- Đã áp dụng và chuẩn hoá được một số kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật tinh sạch ADN, kỹ thuật giải trình tự gen trong nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus VNNB

1.7 Từ kết quả nghiên cứu của đề tài có thể đưa ra kết luận sau

- Đã xây dựng được cây phát sinh loài và bản đồ dịch tễ sự lưu hành của virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 dựa trên trình tự vùng gen E của 34 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, muỗi, lợn, trong các năm 1988 –

2007 Xác định virus VNNB genotyp 1 lưu hành ở cả bốn miền Bắc, Trung,

Nam và Tây Nguyên ở muỗi, lợn trong các năm 2001 - 2007

- Trong số 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân trong các năm 1988

– 2007, tỷ lệ phân lập được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân chiếm tỷ lệ rất thấp 3,7 % (1/27), phần lớn các chủng phân lập từ bệnh nhân thuộc genotyp 3, chiếm tỷ lệ rất cao 96,3 % (26/27) Xác định virus VNNB genotyp 1 có độc lực và tính hướng thần kinh với động vật cảm thụ (chuột ổ

và chuột 11 – 13 gam)

2 BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

a Tiến độ:

Đúng tiến độ

Rút ngắn thời gian nghiên cứu

Tổng số thời gian rút ngắn: 0 tháng

Kéo dài thời gian nghiên cứu

Tổng số thời gian kéo dài 0 tháng

Lý do phải kéo dài

b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đưa ra

Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra

Thực hiện được các mục tiêu nhưng không hoàn chỉnh

Chỉ thực hiện một số mục tiêu đề ra

Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)

c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương

Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong bản đề cương

Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong bản đề cương

Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạ

Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả không đạt chất lượng

Tạo ra được một sản phẩm đạt chất lượng

Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)

X

X

X

d Đánh giá việc sử dụng kinh phí

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng

Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học 300 triệu đồng

Kinh phí từ nguồn khác: không

Toàn bộ kinh phí đã thanh quyết toán: 299.470.000 đ

Chưa thanh quyết toán xong: 530.000 đ

Lý do (ghi rõ):

e Các ý kiến đề xuất

Đề xuất về tài chính: Không

Đề xuất về quản lý khoa học: Không

Đề xuất liên quan đến đề tài:

1 Cần xác định các loài muỗi là vec-tơ truyền virus mới phát hiện (virus Banna) ở Việt Nam

2 Cần giải mã toàn bộ vật liệu di truyền (genome) chủng virus VNNB genotyp 1 phân lập từ bệnh nhân có ký hiệu 90VN70

PHẦN B: BÁO CÁO CHI TIẾT

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tóm lược những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề

tài, tính cấp thiết cần nghiên cứu của đề tài:

Virus viêm não Nhật bản (VNNB) là nguyên nhân chính gây hội chứng não cấp trong khu vực Châu Á và Tây Thái Bình Dương Trước năm

2000, hàng năm ở Việt Nam có khoảng 2000 – 3000 trường hợp viêm não virus, trong những năm 1995, xác định khoảng 67 % trẻ em bị viêm não do virus là do virus VNNB Nhưng gần đây, nhờ tăng cường sử dụng vắc-xin VNNB để phòng bệnh, đã góp phần làm giảm số trường hợp viêm não virus, chỉ có khoảng dưới 1500 trường hợp viêm não virus trong những năm gần đây và trong số này còn có khoảng 10 – 35 % trẻ em bị VNNB, cho thấy khả năng khống chế bệnh VNNB ở Việt Nam là rất khả thi [4,22,24]

Virus VNNB có 5 genotyp, sự phân bố và lưu hành của các genotyp virus VNNB rất khác nhau tuỳ từng vùng địa lý Trước những năm 1990, virus VNNB genotyp 1 lưu hành chủ yếu ở Thái Lan, Campuchia Nhưng từ năm 1990 đến nay, phát hiện có sự mới xuất hiện của virus VNNB genotyp

1 ở một số nước như Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, miền Bắc Việt Nam [1,2,32,42,63] Tuy nhiên, phần lớn các chủng virus VNNB genotyp 1 được phân lập từ muỗi, lợn Do vậy, virus VNNB genotyp 1 được cho là ít

có khả năng gây nhiễm cho người và chỉ thích ứng với muỗi và lợn Chính

vì vậy, ở những nước lưu hành virus VNNB genotyp 1 như Thái Lan, cho đến nay mới phân lập được 5 chủng virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân trong các năm 1979 – 1984, còn các nước khác trong khu vực châu Á, cũng chưa có công bố nào về việc phân lập được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh

nhân sau những công bố về các chủng virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân

Trên thực tế, lựa chọn chủng cho sản xuất vắc-xin phòng bệnh, hoặc chọn chủng để sản xuất kháng nguyên trong chẩn đoán huyết thanh học thường dựa vào kết quả phân tích dịch tễ học phân tử, chủng được lựa chọn thường là chủng có cùng typ hoặc genotyp với chủng lưu hành của địa phương Đối với virus VNNB, dựa trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB, xác định phần lớn các chủng virus VNNB genotyp 3 phân lập

từ người ở các vùng địa lý khác nhau của châu Á [12,13,21] Do vậy, các chủng virus VNNB thuộc nhóm genotyp 3 thường được lựa chọn để làm chủng sản xuất vắc-xin VNNB như chủng Nakayama, chủng Beijing và chủng SA 14; hoặc để sản xuất kháng nguyên như các chủng Nakayama, JaGa-01 và chủng Beijing Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, với sự xuất hiện genotyp mới virus VNNB ở một số vùng địa lý, như chủng virus VNNB genotyp 1 ở một số nước châu Á, hoặc có sự mới xuất hiện virus VNNB genotyp 1 và 2 ở miền Bắc nước Úc trong số các mẫu phân lập từ

muỗi (véc-tơ) truyền bệnh và từ lợn (ổ chứa virus), cho thấy sự cần thiết nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB [18,24,32,34,36]

Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus viêm não Nhật Bản (VNNB), xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1”

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài:

Có sự xuất hiện của các genotyp mới của virus VNNB ở một số vùng khác nhau ở Việt Nam

Virus VNNB genotyp 1 có khả năng gây bệnh cho người

1.3 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định dịch tễ học phân tử virus VNNB ở một số vùng của Việt Nam

- Xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử và thực nghiệm trên động vật cảm thụ

2 TỔNG QUAN

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài

2.1.1 Tác nhân gây bệnh, véc-tơ, ổ chứa virus trong tự nhiên và sự lan rộng của virus VNNB trên thế giới ở một số vùng địa lý

2.1.1.1 Tác nhân gây bệnh

Virus VNNB, một virus Arbo do muỗi truyền gây bệnh viêm não cấp

Theo bảng phân loại mới (thập kỷ 90) virus VNNB thuộc họ Flaviviridae, là một trong 5 họ lớn của virus Arbo Họ Flaviviridae gồm có 3 chi (Genera)

được phân loại dựa vào một trong những cơ sở hình thái học hoặc cấu trúc vật liệu di truyền hoặc liên quan tính kháng nguyên, đó là các chi Hepacivirus, chi Flavivirus và chi Pestivirus

Chi Flavivirus được chia thành 7 phức hệ huyết thanh học, gần một nửa trong số các virus này gây bệnh cho người Những virus gây bệnh cho người thuộc 1 trong 3 phức hệ: phức hệ Tây sông Nil, phức hệ Dengue và phức hệ viêm não do ve; còn virus Sốt vàng chưa được xếp là một phức hệ kháng nguyên, mặc dù nó là chủng đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu của chi Flavivirus Trên cơ sở phân loại bằng huyết thanh học, chi Flavivirus được chia ra thành những phân nhóm nhỏ Virus VNNB thuộc về phân nhóm virus Tây sông Nil, cùng phân nhóm với các virus viêm não thung lũng Murray, virus viêm não St Loui Cho đến nay, virus VNNB được xác định chỉ có một typ huyết thanh duy nhất, nhưng có 5 genotyp [3,23,24]

Virus VNNB được xác định bằng kính hiển vi điện tử là hình cầu, đối xứng hình khối, kích thước virus khoảng 40-50 nm, có vỏ bọc là màng lipit kép Virus VNNB có vật liệu di truyền là ARN sợi đơn dương, chứa toàn bộ thông tin di truyền của virus, chiếm khoảng 6% trọng lượng của virion

Chiều dài sợi ARN của virus VNNB xấp xỉ 11Kb, được cấu tạo bởi 10.976 nucleotid tương ứng 3.432 acid amin (a.a), mã hoá cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc [21,38,43,51]

Protein cấu trúc (structural protein) bao gồm:

- Protein màng - Membrane (M) còn gọi là V1

- Protein lõi - Nuleocapsid (C) còn gọi là V2

- Protein vỏ bao - Envelop (E) còn gọi là V3 Có giả thiết rằng protein

vỏ bao đóng vai trò quan trọng cho sự xâm nhiễm của virus VNNB và

sự khác nhau về độc lực của virus VNNB trong tự nhiên

Protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm 7 protein ký hiệu: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5

- NS1 là glycoprotein rất kỵ nước

- NS2a và NS2b kị nước

- NS3 là protein đa chức năng giúp cho sự xâm nhiễm và nhân lên của

ARN trong tế bào nhiễm virus

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc gen của virus VNNB và sự phiên mã [16]

Đặc điểm của protein cấu trúc:

- Protein capsid (C) – protein lõi là protein hết sức cơ bản, trọng lượng

≈11kd Protein C gấp vào trong một nhị hợp kết thành khối với mỗi một đơn thể có chứa 4 hình xoắn alpha

- Glycoprotein membrane (prM) – glycoprotein màng: glycoprotein prM có trọng lượng ≈ 26 kd

- Glycoprotein Envelope (E) – glycoprotein vỏ có trọng lượng ≈ 53 kd,

là protein chủ yếu trên bề mặt của virus VNNB, là những receptor kết hợp trung gian và làm biến đổi màng tạo kháng thể trung hoà và kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu

Đặc điểm của protein không cấu trúc:

- Protein NS1 ≈ 46 kd, trong giai đoạn nhiễm virus, sự đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ được hình thành để kháng lại protein này

- Protein NS2A & NS2B: protein NS2A là rất nhỏ (≈ 22 kd) là protein

kỵ nước Protein NS2B cũng rất nhỏ (≈ 14 kd)

- Protein NS3 rất lớn (≈ 70kd) là protein có nhiều chức năng

- Protein NS4A & NS4B rất nhỏ (16 kd & 27 kd, tương ứng), là protein

kỵ nước

- Protein NS5 rất lớn (103kd), rất bền vững, là protein có nhiều chức năng với enzym methyltransferase (MTase) và hoạt tính RdRP (RNA dependent RNA polymerase)

Virus VNNB có kháng nguyên ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên trung hoà đó là một glycoprotein trên bề mặt hạt virus (mã hoá bởi vùng gen E), là kháng nguyên tạo kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể

trung hoà, nói một cách khác đây chính là kháng nguyên kích thích cơ thể sinh kháng thể bảo vệ Kháng nguyên kết hợp bổ thể: NS1 là một kháng nguyên kết hợp bổ thể ở dạng hoà tan hoặc kết hợp với thành phần màng nhưng không kết hợp với hạt virus (virion), nó đóng vai trò bảo vệ hạt virus Virus VNNB có tính kháng nguyên chung với những virus cùng chi virus Flavi (Flavivirus genus) Bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu xác định virus VNNB có phản ứng chéo rộng với các virus trong phân nhóm virus Tây sông Nil, với các virus Dengue trong phân nhóm virus Dengue Bằng phản ứng ELISA (MAC-ELISA) đã chứng minh virus VNNB có tính kháng nguyên gần với những virus thuộc phân nhóm virus Tây sông Nil, ít

có phản ứng chéo với những virus thuộc phân nhóm Dengue [1,2,8,22,27]

Do vậy, để xác định vai trò gây bệnh của các genotyp virus VNNB không thể dựa vào chẩn đoán huyết thanh học [1]

2.1.1.2 Sự thích ứng của virus VNNB trên động vật cảm thụ và trên tế bào

Virus VNNB thích ứng với một số động vật cảm thụ như chuột ổ, chuột

11 – 13 gam, chuột Hamster, phôi trứng 9 – 11 ngày tuổi Đối với một số

loài muỗi, virus VNNB thích ứng và nhân lên ở một số loài muỗi như Aedes

albopictus, Toxrhynchites Đối với các dòng tế bào nguyên phát tế bào phôi

gà, tế bào thường trực có nguồn gốc từ động vật có vú như tế bào Vero, tế bào BHK21, hoặc có nguồn gốc muỗi như tế bào C6/36 là những dòng tế bào nhậy cảm với virus VNNB [25,38] Chính vì vậy, vắc xin VNNB đã được nghiên cứu sản xuất từ não chuột gây nhiễm virus VNNB cho mục đích phòng bệnh Cho đến nay, vắc-xin VNNB được nghiên cứu sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau như từ não chuột, từ tế bào thường trực Vero nhưng vắc-xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột vẫn là vắc-xin được sử dụng rộng rãi [24,57]

2.1.1.3 Véc-tơ, ổ chứa virus VNNB trong tự nhiên

Bệnh VNNB do muỗi mang virus truyền, bệnh chỉ xuất hiện ở người khi có điều kiện sinh thái thích hợp, virus VNNB không truyền từ người sang người qua muỗi đốt Chu trình sinh thái của virus VNNB trong tự nhiên

là liên tục, đối với các vùng nhiệt đới bệnh VNNB xuất hiện rải rác quanh năm, nhưng đối với những vùng ôn đới hoặc cận nhiệt đới thì dịch VNNB thường xảy ra vào mùa hè Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá trình xẩy ra dịch như mối quan hệ giữa véc-tơ và ổ chứa, mật độ véc-tơ, khả năng truyền virus của véc-tơ, tập quán sinh hoạt của dân cư, việc sử dụng vắc-xin phòng bệnh [3,5,10,11] Nghiên cứu xác định ổ chứa virus VNNB là các loài chim, muỗi và nhiều loài động vật máu nóng khác đặc biệt là lợn được coi là vật chủ khuếch đại mầm bệnh [3,5,41,67] Chính vì vậy, virus VNNB lưu hành trong tự nhiên ở động vật có xương sống hoang dại hoặc động vật nuôi trong nhà và muỗi hút máu

Cho đến nay, virus VNNB đã được phân lập từ khoảng 30 loài muỗi

thuộc 5 giống Culex, Anopheles, Aedes, Mansonia và Amergeres; trong đó

Culex (Cx), đặc biệt là Cx Tritaeniorhynchus là véc-tơ chính trong việc

truyền bệnh Virus VNNB thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi ở 270 C–

300 C, mỗi lần muỗi đốt có tới 100.000 MLD (liều chí tử tối thiểu) đối với chuột nhắt Nếu dưới 200C sự nhân lên của virus bị chậm hoặc ngừng lại Do vậy, bệnh VNNB thường xuất hiện về mùa hè ở các vùng cận nhiệt đới, đó

là khoảng thời gian thích hợp cho virus nhân lên trong cơ thể muỗi và cũng

là thời gian chỉ số mật độ muỗi cao nhất trong năm [17,24,60]

2.1.1.3 Sự lan rộng và xuất hiện của genotyp mới virus VNNB ở một số vùng địa lý trên thế giới

Bệnh viêm não do virus VNNB lan truyền rộng rãi ở Châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn đông, hầu hết các nước ở Đông Nam Châu Á và Ấn Độ, theo số liệu thống kê hàng năm ở Châu Á có khoảng 50.000 trường hợp mắc [24,33,60]

Việc tăng cường sử dụng vắc-xin VNNB đã khống chế bệnh VNNB ở một số nước như Nhật Bản, Nam Triều Tiên Ngược lại, tỷ lệ VNNB lại tăng lên ở Srilanca, Nepal, Ấn Độ và Trung Quốc Do vậy, VNNB vẫn còn là một

đề cần quan tâm ở nhiều nước trong đó có Việt Nam, vì tỷ lệ sử dụng xin VNNB để phòng bệnh còn thấp [7,24]

vắc-Trong vài thập kỷ gần đây, bệnh VNNB đã lan rộng tới một số vùng trước đây không có bệnh dịch này như quần đảo thuộc eo biển Torres cách

xa lục địa Australia Có giả thiết về sự lan rộng của virus VNNB ở một số vùng địa lý mới là do chim di cư mang virus đến, nhưng cho đến nay vẫn chưa có công bố nào về kết quả phân lập virus từ chim di cư [14,15,20]

2.1.2 Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus VNNB ở khu vực châu Á

Phân tích về sự phát triển, tiến hoá của virus VNNB dựa vào cấu trúc vùng gen Pr.M của virus VNNB đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, đây là vùng gen có độ dài khoảng 500 bp và tương đối ổn định

Do vậy, nghiên cứu về sự tiến hoá của virus VNNB có thể sẽ bị hạn chế nếu

sử dụng vùng gen này Ngược lại, vùng gen E với độ dài 1500 bp, là vùng

không ổn định, được cho là vùng gen lý tưởng để nghiên cứu về sự tiến hoá của virus VNNB [1,18,23,29,42,50]

2 2 2

2

3 3

3 3

3

3 3 3

1

1 1

3 3

3

5 4

1 1 1

Hình 2.2 Sự phân bố các genotyp virus VNNB trên thế giới

Nghiên cứu dịch tễ phân tử đã xác định, virus VNNB có 5 genotyp, tính chất gây bệnh cũng khác nhau đối với từng genotyp Trên thực tế, các chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ở nhiều nước trong khu vực châu

Á chủ yếu là các chủng virus VNNB thuộc genotyp 3; virus VNNB genotyp

2 chỉ được phân lập ở Malaysia, Indonesia và Bắc Úc, virus VNNB genotyp

1 được phân lập chủ yếu ở Thái Lan Ngược lại, đối với virus VNNB genotyp 4 và 5 vai trò gây bệnh chưa được xác định rõ ràng và cho đến nay hai genotyp này mới được phân lập từ muỗi và chim Virus VNNB genotyp

4 bao gồm một số chủng virus phân lập được từ muỗi ở Indonesia, qua thực nghiệm cho thấy độc lực của virus VNNB genotyp 4 thấp hơn so độc lực của các chủng virus VNNB genotyp 3 Có giả thiết cho rằng, nếu gây bệnh virus VNNB genotyp 4 sẽ gây bệnh nhẹ hơn virus VNNB genotyp 3 [18,39,45]

Sự xuất hiện virus VNNB genotyp 1 ở một số nước bắc Á được ghi nhận lần đầu tiên ở Nam Triều Tiên, Nhật Bản vào năm 1994, đó là những chủng virus genotyp 1 được phân lập từ muỗi Trong nghiên cứu gần đây, xác định

có vật liệu di truyền của virus VNNB genotyp 1 và genotyp 3 trong mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân ở Nhật Bản, tuy nhiên cho đến nay virus VNNB genotyp 1 vẫn chưa được phân lập từ bệnh nhân ở Nhật Bản [26,30,32,45,50] Tương tự như vậy, nghiên cứu dịch tễ phân tử các chủng virus VNNB phân lập ở Trung Quốc trong các năm 1949 – 2005 cũng đã phát hiện virus VNNB genotyp 1 lưu hành ở Trung Quốc từ những năm

1979 ở muỗi, tuy nhiên trong số 135 chủng virus VNNB được sequencing vùng gen E để xác định genotyp, mới phát hiện được virus VNNB genotyp 1

từ muỗi và máu lợn, nhưng chưa phát hiện được virus VNNB genotyp 1 từ bệnh nhân [62]

Mặc dù có sự xuất hiện của các genotyp mới ở một số vùng địa lý trong những năm gần đây, tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học để giải thích cho sự mới xuất hiện genotyp mới này Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của virus VNNB thường dựa vào kết quả phân tích trình tự các vựng gen mã hoá cho protein cấu trúc và phi cấu trúc như vùng gen E, PreM hoặc NS5 [52,53] Xác định virus VNNB genotyp 1 chủ yếu mới xuất hiện ở vùng Bắc

Á và đông Nam châu Á, chưa thấy có sự xuất hiện virus VNNB genotyp 1 ở các nước vùng Nam Á như Ấn Độ, Malaysia [45,50]

Nghiên cứu sinh học phân tử virus VNNB được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong nhiều thập kỷ qua đã làm phong phú

số lượng các vùng gen của virus VNNB đã được giải mã và đăng ký trong ngân hàng gen Hơn thế nữa, nghiên cứu giải mã toàn bộ gen của một chủng virus VNNB cũng đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện, đăng ký trong ngân hàng gen Tuy nhiên, kết quả giải mã toàn bộ vật liệu di truyền của các chủng virus VNNB phân lập từ người đã công bố trong ngân hàng gen chủ yếu là các chủng virus VNNB genotyp 3 như chủng Nakayama, Beijing -1 Cho đến nay, chưa có công bố nào trong ngân hàng gen về kết quả giải mã gen đối với virus VNNB genotyp 1 phân lập từ bệnh nhân [12,37,39]

2.1.3 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu trên thế giới

Năm 1983 Mullis K B đã phát minh ra nguyên lý phản ứng kỹ thuật PCR và công bố cho giới khoa học vào tháng 10 năm 1985 Phát minh của ông đã trở thành một cuộc cách mạng lớn trong khoa học kỹ thuật Tiếp sau

đó, là hàng loạt các công bố về phát hiện và phát triển những enzyme mới ứng dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử và phát triển kỹ thuật mới cho nghiên cứu định lượng cũng như định tính sản phẩm tổng hợp cuả kỹ thuật PCR Về nguyên lý, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại trong ống nghiệm một đoạn ADN đã được biết trình tự hai đầu ADN gồm 3 giai đoạn chuyển đổi: (1) Làm biến tính sợi kép ADN; (2) Gắn sợi đơn ADN với 1 cặp mồi đặc hiệu; (3) Sự kéo dài chuỗi mồi bằng enzyme polymeraza [28,56] Chu trình được lặp di lặp lại rất nhiều lần, ADN được khuếch đại theo cấp số nhân Về nguyên bản gốc, kỹ thuật PCR là khuếch đại một đoạn ADN, nhưng đối với các virus có vật liệu di truyền là ARN như virus VNNB,

phương pháp này lại không thể áp dụng trực tiếp cho sự nhân lên của ARN được Nên kỹ thuật PCR đã cải biên thành kỹ thuật RT-PCR trong đó ARN của virus được chuyển đổi thành ADN bổ trợ - complementary DNA được gọi là cDNA Như vậy, ARN nguyên bản của virus được chuyển thành cDNA là một sợi đơn ADN bổ trợ Vì phản ứng PCR bao gồm cả hai giai đoạn sao chép ngược và tổng hợp ADN, nên qui trình này được gọi là phản ứng chuỗi sao chép ngược - reverse transciptase polymerase chain reaction - gọi tắt là RT-PCR, thực chất là một sự cải biên từ kỹ thuật PCR

Với kỹ thuật RT-PCR, nếu quá trình thực hiện được chia làm hai giai đoạn: giai đoạn sao chép ngược để tổng hợp cDNA sử dụng mồi ngược và giai đoạn PCR Mỗi một giai đoạn sử dụng một ống nghiệm riêng biệt với những thành phần cần thiết và chu trình nhiệt riêng, được gọi là kỹ thuật RT-PCR gián tiếp Ưu điểm của kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn kỹ thuật RT-PCR trực tiếp Tuy nhiên, khả năng dương tính giả cao hơn kỹ thuật RT-PCR trực tiếp do dễ bị nhiễm Do vậy, kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có hiệu quả hơn so với kỹ thuật RT-PCR gián tiếp, vì nó sẽ làm giảm tối đa khả năng tạp nhiễm hoặc kết quả đương tính giả Để thực hiện kỹ thuật, tất cả các thành phần cần thiết cho cả hai quá trình sao chép ngược và PCR được cho vào một ống nghiệm, thực hiện trong một lần duy nhất, chu trình nhiệt không bị ngắt quãng Một trong hai đoạn mồi sử dụng cho quá trình sao chép ngược được sử dụng cho PCR [28,56]

Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PT-PCR được khẳng định và kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di trên gel Cho đến nay có nhiều loại thuốc nhuộm đã được nghiên cứu để ứng dụng cho việc phát hiện sản phẩm PCR như Ethidium bromide, SYBR Green, FABIO , nhưng Ethidium bromide

vẫn là loại thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi, mặc dù nó là một chất gây ung thư tiềm tàng, nên vẫn đề an toàn sinh học cần được coi trọng để tránh làm ô nhiễm môi trường và người thực hiện kỹ thuật [6,28]

Để thực hiện được kỹ thuật RT-PCR, việc chuẩn bị mẫu ARN của virus cũng rất quan trọng Có nhiều kỹ thuật tách chiết vật liệu di truyền của virus, nhưng có thể phân chia thành hai nhóm kỹ thuật cơ bản: (1) Nhóm tách chiết ARN bằng hoá học; (2) Nhóm tách chiết ARN bằng cột Spin column [6,19,23,28]

Trong hầu hết các kỹ thuật PCR, vật liệu di truyền thường được tách chiết bằng hoá chất theo phương pháp phenol – chloroform (trong các thường quy khác sử dụng chloroform – butanol) Khi sử dụng phenol để chiết xuất ARN, Trizol LS là một dung môi có phenol và guanidine isothiocyanate, giữ cho ARN được nguyên vẹn trong lúc mẫu được làm đồng nhất, được ly giải, các tế bào bị phá vỡ và các thành phần của tế bào bị làm tan rã Khi cho thêm chloroform và ly tâm, tách hỗn dịch trên thành 3 lớp rất rõ: ARN nguyên vẹn ở trong pha nước trên cùng, protein và ADN của tế bào nằm trong lớp giữa hoặc lớp dung môi bên dưới Sau khi chuyển pha nước sang một ống nghiệm khác, ARN sẽ được tủa bằng isopropyl – alcohol và ethanol 75 % Phương pháp này ít tốn kém nhưng cần có khoảng

3 - 4 giờ mới hoàn thiện giai đoạn tách chiết

Do vậy, những nghiên cứu phát triển kit tách chiết ARN của nhiều hãng trên thế giới đã cho phép rút ngắn thời gian tách chiết ARN xuống còn khoảng 20 phút, thao tác kỹ thuật đơn giản, không phải tiếp xúc với những

hoá chất độc hại, đáp ứng rất nhanh trong chẩn đoán phát hiện sớm tác nhân gây bệnh Chính vì vậy, phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi, đặc biệt thích ứng với những mẫu có lượng ARN < 50 ng, tuy nhiên giá thành cao hơn so với phương pháp sử dụng hoá chất [28]

Như ta đã biết, ARN của virus không bền vững ở điều kiện tự nhiên, ARN của virus trong mẫu xét nghiệm có thể bị tiêu huỷ theo thời gian ngay

ở điều kiện –700C; Làm đông tan băng mẫu nhiều lần có thể làm vật liệu di truyền của virus bị phân đoạn dẫn đến làm giảm độ nhậy của kỹ thuật PCR; Tất cả các quá trình thúc đẩy sự thoái hoá ARN của virus cần được loại bỏ trong quá trình thực hiện kỹ thuật tách chiết [28]

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

2.2.1 Tình hình bệnh VNNB và sự đa dạng của các loài muỗi Culex truyền VNNB ở một số vùng địa lý của Việt Nam

2.2.1.1 Tình hình bệnh VNNB ở Việt Nam

Ở Việt nam, bệnh VNNB được ghi nhận từ năm 1952, vụ dịch viêm não mùa hè năm 1959 ở Miền Bắc đã được xác định là do virus VNNB Cho đến nay, dịch vẫn xảy ra hàng năm, khắp các vùng nông thôn thuộc các tỉnh đồng bằng, miền núi, trung du Các ổ dịch phần lớn tập trung tại các vùng đồng bằng trồng lúa nước hoặc vùng bán sơn địa, sự lan rộng của virus VNNB đến những vùng địa lý mới ở Việt Nam đã được ghi nhận trong thập

kỷ gần đây như ở Hà Giang, Điện Biên [4,11,33]

Trong những năm đầu của thập kỷ 90, với thành công của nhóm các nhà khoa học Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, đã nghiên cứu áp dụng

thành công quy trình sản xuất vắc xin VNNB tinh khiết, bất hoạt từ não chuột tại đạt tiêu chuẩn tổ chức Y tế thế giới Sau kết quả đánh giá lâm sàng

về hiệu quả phòng bệnh trong những năm 1993 - 1995 ở huyện Gia Lương, tỉnh Hà Bắc (cũ), khẳng định vai trò phòng bệnh của vắc-xin Từ năm 1997, vắc-xin VNNB được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng để tiêm phòng cho trẻ em, đã góp phần từng bước khống chế bệnh VNNB ở Việt Nam Tuy nhiên, việc cung cấp vắc-xin phòng VNNB trong chương trình tiêm chủng mở rộng chủ yếu là 3 liều cơ bản, việc tiêm nhắc lại định kỳ sau

3 – 4 năm tuỳ thuộc vào điều kiện kinh tế cũng như ý thức phòng VNNB cho trẻ em của từng gia đình Do vậy, sau tiêm vắc-xin VNNB 5 – 7 năm, có một số trẻ em vẫn bị mắc VNNB [4] Cho thấy, để khống chế bệnh VNNB trong tương lai ở Việt Nam, cần có chính sách hỗ trợ tiêm phòng vắc-xin VNNB đầy đủ các liều cơ bản và các liều củng cố cho đến khi trẻ 15 tuổi

2.2.1.2 Sự đa dạng của các loài muỗi Culex truyền VNNB ở một số vùng địa

lý của Việt Nam

Virus VNNB được phân lập chủ yếu từ một số loài muỗi Culex như

Cx Tritaeniorhynchus, Cx Vishnui, Cx Gelidus, Cx Quinquefaciatus Mặt

khác, các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh virus VNNB được truyền

sang thế hệ khác qua trứng muỗi ở loài Cx Tritaeniorhynchus Nghiên cứu

xác định tần xuất nhiễm virus VNNB trong quần thể quanh năm đã xác định

có sự tồn tại của virus VNNB qua mùa đông trong cơ thể muỗi ở miền Bắc Việt Nam Nhưng dịch VNNB thường xẩy ra ở miền Bắc trong các tháng hè

do có liên quan với mật độ các loài muỗi Cx Tritaeniorhynchus, Cx

Vishnui, Cx Gelidus rất cao trong các tháng 4, 5 và 6 [5,10,11] Nghiên cứu

cho thấy, ở miền Bắc, miền Trung, virus VNNB chủ yếu được phân lập từ

các loài muỗi Cx Tritaeniorhynchus, Cx Vishnui, Cx Gelidus, nhưng ở

miền Nam và Tây Nguyên, ngoài các véc-tơ này, virus VNNB còn được

truyền bởi các loài muỗi Cx Quinquefaciatus, Cx Fatigan [2,4,5,10] Cho

thấy có thể còn có loài muỗi khác là véc-tơ truyền virus VNNB ở Việt Nam vẫn chưa được phát hiện

2.2.2 Tình hình nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB ở Việt Nam

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus VNNB ở Việt nam còn hạn chế Nghiên cứu trước đây xác định trình tự nucleotit vùng gen C, M của các chủng virus VNNB phân lập ở miền Bắc và miền Nam trong các năm 1964 –

1988 đã xác định các chủng virus VNNB phân lập trong khoảng thời gian này thuộc nhóm genotyp 3, chúng có họ hàng với chủng Nakayama của Nhật Bản và Beijing-1 của Trung Quốc Tuy nhiên những chủng virus này tạo thành 2 phân nhóm nhỏ tách biệt giữa các chủng phân lập ở miền Bắc với các chủng phân lập ở miền Nam [23] Một số nghiên cứu khác về sinh học phân tử của virus VNNB cũng được thực hiện, nhưng chủ yếu là so sánh sự tương đồng về vật liệu di truyền của các các chủng sản xuất vắc-xin với các chủng tự nhiên như so sánh sự tương đồng về nucleotide và axit amin của chủng Nakayama với chủng phân lập từ bệnh nhân năm 1993 (cùng nhóm genotyp 3), hoặc phát hiện có sự xuất hiện genotyp 1 ở miền Bắc Việt Nam

từ muỗi và lợn trong những năm đầu thế kỷ 21 [42] Nên những nghiên cứu mang tính tổng thể về dịch tễ học phân tử của virus VNNB ở Việt Nam đặc biệt là sự lưu hành của virus VNNB genotyp 1, hoặc giải mã toàn bộ vật liệu

di truyền của một chủng virus VNNB phân lập ở Việt Nam, hoặc xác định vai trò gây bệnh của virus VNNB genotyp 1 là những nghiên cứu cần được thực hiện

Trên thực tế, việc phân lập virus từ bệnh nhân ít đạt kết quả, hơn nữa virus VNNB genotyp 1 được cho là thích ứng với muỗi, lợn hơn là người, do vậy để xác định sự lưu hành virus VNNB genotyp 1 ở Việt Nam, việc phân lập virus từ muỗi, lợn là mục tiêu chính mang tính khả thi để xác định sự lưu hành của virus VNNB genotyp 1 [1,5] Tuy nhiên, để khẳng định virus VNNB genotyp 1 gây bệnh, việc phân lập, giải mã gen các chủng virus VNNB phân lập từ người là cần thiết, mặc dù việc phân lập virus VNNB từ dịch não tuỷ bệnh nhân có tỷ lệ dương tính thấp [6,8,9]

2.2.3 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu virus VNNB ở Việt Nam

Ở Việt Nam, kỹ thuật sinh học phân tử đã được đưa vào ứng dụng trong nghiên cứu từ những năm đầu của thập kỷ 90 Nhưng trong khoảng mười năm trở lại đây, kỹ thuật này đã trở thành thường quy của nhiều phòng thí nghiệm ứng dụng trong chẩn đoán xác định một số bệnh về máu cũng như những bệnh dịch truyền nhiễm Đối với lĩnh vực VNNB, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu về virus VNNB đã được thực hiện từ những năm 90 với sự hợp tác của Viện Pasteur Paris [23] Khoảng mười năm tiếp sau đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu đã được thúc đẩy phát triển mạnh mẽ hơn với sự hợp tác của Viện Y học Lâm sàng Nhiệt Đới, Trường Đại học Nagasaki Nhật Bản; Trung tâm kiểm soát bệnh tật Fort Collins, Hoa Kỳ và Viện Pasteur Paris [6,42] Đây chính là cơ

sở để phát triển về dịch tễ phân tử trong lĩnh vực virus VNNB nói riêng và một số tác nhân virus khác gây viêm não ở Việt Nam

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tiến cứu kết hợp với nghiên cứu hồi cứu

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu

3.2.1 Chọn mẫu

3.2.1.1 Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu tiến cứu

Có 550 mẫu dịch não tuỷ bệnh nhân hội chứng não cấp nghi ngờ do virus, thu thập tại bệnh viện của một số tỉnh thành miền Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên trong các năm 2004 – 2007

Có 580 mẫu muỗi được thu thập ở miền Bắc (Hà Tây), Miền Trung (Quảng Bình), miền Nam (Long An, Cần Thơ) và Tây Nguyên (Gia Lai) trong các năm 2004 - 2007

Có 2700 mẫu máu lợn được thu thập ở miền Bắc (Hà Tây), miền Nam (Long An) và Tây Nguyên (Gia Lai) từ lợn 2 tháng tuổi, trong các năm 2004 – 2007

3.2.1.2 Các chủng virus

Trong nghiên cứu này sử dụng 34 chủng virus VNNB bao gồm có 21 chủng virus VNNB phân lập trong các năm 1988 – 2003 và 13 chủng virus VNNB phân lập trong các năm 2004 – 2007 Trong số này có 27 chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ở miền Bắc, miền Trung và 7 chủng virus VNNB phân lập từ muỗi, lợn ở miền Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên

Sử dụng 21 chủng virus VNNB là các chủng phân lập tại Việt Nam

và các nước trong khu vực đã được xác định trình tự vùng gen E công bố

trong ngân hàng gen, ngoài ra sử dụng trình tự vùng gen E của chủng virus

viêm não thung lũng Muray (Murray Valley Encephalitis virus - MVEV)

Bảng 3.1 Thông tin về 21 chủng virus VNNB được sử dụng

để so sánh trình tự vùng gen E và xây dựng cây phả hệ

Chủng Năm Quốc gia Genotype Loại bệnh phẩm Số đăng ký GenBank

thanh lợn

AY316157

86VN206 1986 miền Bắc Việt Nam G3 Não tử thi AY376460 86VN207 1986 miền Bắc Việt Nam G3 Não tử thi AY376461 89VN49 1989 miền Bắc Việt Nam G3 Não tử thi AY376462 89VN50 1989 miền Bắc Việt Nam G3 Não tử thi AY376463

3.2.2 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu dự kiến thực hiện giải trình tự gen để phân tích về dịch tễ học

phân tử của virus VNNB là 27 chủng virus Trên thực tế, thực hiện nghiên

cứu phân tích 34 chủng virus VNNB để làm phong phú thêm số liệu

3.2.3 Đối tượng nghiên cứu

Trình tự vùng gen E của các chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân, từ véc-tơ truyền bệnh (muỗi), từ ổ chứa virus (lợn) cần được nghiên cứu, so sánh với nhau và với 21 chủng virus VNNB đã công bố trình tự vùng gen E trong ngân hàng gen

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3 3.1 Chỉ tiêu nghiên cứu

Phân lập được các chủng virus VNNB từ muỗi, từ máu lợn, từ mẫu

dịch não tuỷ của bệnh nhân có hội chứng não cấp bằng tế bào Aedes

albopictus dòng C6/36 Kết quả định loại virus VNNB được xác định bằng

kỹ thuật ELISA Sandwich

Các chủng virus VNNB được khuếch đại vùng gen E bằng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp Sản phẩm của kỹ thuật PCR được tinh sạch, làm vật liệu cho phản ứng giải trình tự gen với các mồi xuôi và môi ngược đặc hiệu virus VNNB, các mồi này được thiết kế trong vùng gen E (inner primer)

Xác định đặc điểm di truyền của virus VNNB qua kết quả giải mã và phân tích đoạn gen E, trên cơ sở đó vẽ được bản đồ dịch tễ về sự phân bố virus VNNB genotyp 1 ở Việt Nam

Khẳng định được virus VNNB genotyp 1 cũng có khả năng gây bệnh bằng kết quả giải trình tự gen chủng virus VNNB phân lập từ bệnh nhân ở Việt Nam và bằng kết quả thử nghiệm độc lực của virus trên động vật cảm thụ (chuột ổ và chuột 11 – 13 gam)

Bản đồ dịch tễ về sự lưu hành các genotyp khác nhau của virus VNNB để xác định mối liên quan giữa các chủng virus trên người, ổ chứa và véc-tơ truyền bệnh để dự báo khả năng gây bệnh của chúng

3.3.2 Quy trình kỹ thuật

3.3.2.1 Quy trình kỹ thuật thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm

Quy trình kỹ thuật thu thập và bảo quản mẫu dịch não tuỷ: Dịch não tuỷ

để phân lập virus VNNB được thu thập trong 5 ngày đầu sau phát bệnh, lấy khoảng 2 ml (do bác sỹ điều trị lấy), bảo quản ở điều kiện - 800C; mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm bằng đá khô hoặc bình ni-tơ lỏng và được giữ ở

- 800C cho đến khi phân lập

Quy trình kỹ thuật thu thập và bảo quản mẫu máu lợn: Máu lợn được lấy

từ lợn 2 tháng tuổi, mỗi tuần thu thập máu lợn 1 lần Máu lợn được chia ra làm 2 tuýp: 1 tuýp lưu giữ ở 40C, tách lấy huyết thanh phát hiện kháng thể

ức chế ngưng kết hồng cầu kháng virus VNNB để sàng lọc xác định những mẫu trước khi có chuyển đổi kháng thể; 1 tuýp được lưu giữ ở - 800C, sau khi có kết quả sàng lọc xác định những mẫu trước khi có chuyển đổi kháng thể, chọn và lưu giữ những mẫu này để phân lập virus VNNB

Quy trình thu thập, định loại và bảo quản mẫu muỗi: Muỗi được thu thập

ở miền Bắc; ở miền trung, miền Nam và Tây Nguyên, muỗi được thu thập ở những nơi có bệnh nhân VNNB Muỗi được bắt trong nhà, trong chuồng gia súc gần nhà, thời gian bắt muỗi từ 6 giờ đến 9 giờ tối Muỗi được bắt bằng bẫy, hoặc bằng vợt Muỗi thu thập được chuyển sang lồng lưu giữ muỗi, bảo quản trong điều kiện có đủ độ ẩm, dinh dưỡng trong quá trình vận chuyển Muỗi thu thập tiêu hết máu trong dạ dầy, định loại muỗi tại phòng thí nghiệm Côn trùng của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung ương và các Viện khu vực dựa theo đặc điểm hình thể ngoài theo khoá định loại của CDC Các cá thể muỗi cùng loài được hộn thành một mẫu để trong tuýp loại 1,8 ml, mỗi mẫu muỗi có khoảng 20 đến 60 cá thể muỗi Tuýp đựng muỗi cần ghi đầy đủ thông tin: tên loài muỗi, số lượng, địa điểm thu thập mẫu muỗi được lưu giữ ở - 800C cho đến khi phân lập

3.3.2.2 Phõn lập và định loại virus VNNB theo quy trỡnh chuẩn thức phũng

thớ nghiệm

Virus VNNB được phõn lập bằng tế bào Aedes albopictus dũng C6/36 Mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý được gõy nhiễm tế bào C6/36 một lớp được nuụi cấy trờn chai nhựa nuụi cấy tế bào loại 25 cm2 Sau 4- 5 ngày, kiểm tra nước nổi tế bào gõy nhiễm bệnh phẩm bằng kỹ thuật ELISA Sandwich để phỏt hiện virus hoặc khỏng nguyờn virus Những mẫu xỏc định dương tớnh bằng kỹ thuật ELISA Sandwich được lưu giữ và cấy truyền lần thứ hai, lấy nước nổi để tỏch chiết vật liệu di truyền để khuyếch đại vựng gen E

Đối với những chủng virus đó phõn lập trong những năm trước đõy,

cần cấy chuyển lại chủng virus trờn tế bào Aedes albopictus dũng C6/36, sau

4 – 5 ngày, thu hoạch nước nổi, lấy mẫu tỏch chiết vật liệu di truyền cho kỹ thuật sinh học phõn tử

(Các loài muỗi Culex…) Bệnh nhân

(não tử thi, dịch não tuỷ)

Xử lý

Phân lập virus (chuột ổ, trên tế bào)

Phát hiện vật liệu di truyền của virus Bằng kỹ thuật RT-PCR

Xác định virus bằng

kỹ thuậtELISA Sandwich

Xác định genotyp Bằng kỹ thuật sequencing

Sơ đồ 3.1 Quy trỡnh phõn lập và định loại virus VNNB

3.3.2.4 Quy trình giải trình gen từ mẫu virus VNNB

Sơ đồ 3.2 Tóm tắt sơ đồ thực hiện giải trình tự gen virus VNNB

Mẫu virus VNNB đã sàng lọc

Tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Thực hiện phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen đặc hiệu

Tách chiết ARN của vius

Quy trình giải mã gen virus được thực hiện tại phòng thí nghiệm virus Viêm não/Arbo, Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương Trong quá trình thực hiện

kỹ thuật từ giai đoạn tách chiết vật liệu di truyền đến các giai đoạn tiếp theo như tinh sạch sản phẩm PCR, làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR giải trình tự và tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự được kiểm tra bằng điện di trên gel và bằng máy quang phổ để xác định hàm lượng ARN/ADN

Kỹ thuật tách chiết vật liệu di truyền ARN

Nguyên lý kỹ thuật: Sử dụng một dung dịch AVL (có chất mang ARN) để ly giải virus, khi cho mẫu cần tách chiết ARN vào dung dịch AVL, virus nếu

có trong mẫu sẽ bị ly giải, ARN của virus sẽ được gắn vào chất mang ARN Với sự có mặt của cồn 100%, ARN của virus sẽ bị tủa Khi cho lọc qua màng QIA amp Silicagel, ARN của virus sẽ được gắn chọn lọc trên màng QIA amp Silicagel nhờ chất mang ARN Sử dụng dung dịch rửa AW1, AW2

để loại các thành phần tạp bám trên màng QIA amp Silicagel Dung dịch chiết xuất AVE sẽ tách ARN của virus bám trên màng QIA amp Silicagel Các bước thực hiện kỹ thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất:

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly giải AVL có chứa chất mang ARN theo thường quy đi kèm bộ sinh phẩm

Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tuýp eppendorf có 560 µl dung dịch ly giải AVL có chất mang ARN, trộn bằng máy trộn (máy Vortex) khoảng 15 giây,

để tạo một hỗn dịch đồng nhất giữa mẫu và dung dịch AVL Ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong 10 phút, đảm bảo các hạt virus bị ly giải hoàn toàn, khi virus bị ly giải ARN được gắn vào chất mang ARN, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 3 giây để chuyển các giọt dính trên nắp và thành tuýp xuống

Bước 3: Cho 560 µl ethanol 100% vào tuýp eppendoff trên, trộn đều bằng máy trộn trong vòng 15 giây, ethanol sẽ tủa các sợi ARN lại Sau đó ly tâm

ly tâm 8.000 vòng/phút/ 3 giây để chuyển các giọt dính trên nắp và thành tuýp xuống

Bước 4: Chuẩn bị cột QIA amp spin được đặt vào tuýp 2 ml (collection tube) Cho 630 µl (một nửa số mẫu trên) vào cột QIA amp spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút Tất cả ARN sẽ được gắn trên bề mặt màng Silicagel với sự có mặt của chất mang ARN, loại bỏ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml

Bước 5: Cho nốt phần mẫu còn lại (630 µl) vào cột QIA amp spin trên, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút Đổ phần dịch lọc trong tuýp 2 ml, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml

Bước 6: Cho 500 µl dung dịch rửa AW 1 có chứa ethanol 100% vào cột QIA apm spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, để loại bỏ các thành phần không phải là ARN có trên mặt màng Silicagel Đổ phần dịch lọc trong tuýp

2 ml, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml

Bước 7: Cho 500 µl dung dịch rửa AW 2 có chứa ethanol 100% vào cột QIA apm spin, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút, để loại bỏ các thành phần không phải là ARN có trên mặt màng Silicagel Loại bỏ tuýp 2 ml có chứa dịch lọc, đặt cột QIA amp spin vào tuýp 2 ml mới

Bước 8: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa

Bước 9: Chuyển cột QIA amp spin vào tuýp eppendorf sạch 1.5 ml Mở rất nhẹ nhàng nắp cột QIA amp spin, cho 60 µl dung dịch AVE Đậy nắp để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút Tất cả ARN có trong mẫu sẽ được tách khỏi màng Silicagel bằng dung dịch AVE là

dung dịch không có Rnase, có chứa 0,04% sodium azide Khi ly tâm toàn bộ ARN của mẫu sẽ được thu hồi trong dịch lọc đựng trong tuýp eppendorf sạch 1.5 ml

ARN sau tách chiết có thể được lưu giữ ở –20oC hoặc –70oC trong khoảng 1 năm

Kỹ thuật RT-PCR trực tiếp

Nguyên lý: Kỹ thuật RT-PCR trực tiếp là sự khuếch đại trình tự ARN của

virus với cặp mồi đặc hiệu của virus khi có mặt đồng thời 3 enzym là Reverse transcriptase (RTse), ADN polymerase và Rnase H cùng với sự có mặt của ion Magê và dNTP Trong toàn bộ quá trình, ARN của virus được chuyển đổi một lần thành cDNA với sự có mặt của enzyme RTse Tiếp đó cDNA được khuếch đại hàng nghìn lần bởi enzyme chịu nhiệt ADN polymerase, sự nhân lên của ARN virus bị ức chế bởi enzyme Rnase H Sản phẩm khuếch đại của phản ứng RT-PCR được khẳng định và kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di trên gel agarose

Công thức cho một phản ứng RT-PCR trực tiếp

Thành phần của kít

(loạt số:………)

Nồng độ ban đầu

Nồng độ Cuối cùng 1 tube

Reverse primer (mồi ngược) 50 µM 0.4 µM 0.5 µl

10 µl ARN đã tách chiết + 40 µl hỗn hợp trên ( Mix)

Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR

Nhiệt độ (0C) (Phút:giây) Thời gian Số lượng chu kỳ

500 C

940 C

30:00 05:00

940 C

640 C

720 C

00:45 00:45 01:30

Kỹ thuật kiểm tra sản phẩm PCR

Nguyên lý: Dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic là các đại phân tử

tích điện âm, dưới tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương Điện di là quá trình chuyển phân tử tích điện trong dung dịch, sử dụng một điện trường chạy qua Trong điện trường các phân tử tích điện di chuyển với một tốc độ khác nhau phụ thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thước của nó và đặc tính sàng lọc của gel Kích thước lỗ, đặc tính sàng lọc của gel agarose được xác định bằng sự điều chỉnh nồng độ agarose để tạo gel Với nồng độ agarose càng cao, kích thước lỗ gel càng nhỏ Do vậy, tuỳ theo

độ dài của sản phẩm PCR để chọn nồng độ gel agarose phù hợp

Các axit nucleic khi di chuyển trong gel agarose sẽ được phát hiện dưới tia tử ngoại (UV) theo nguyên lý hoá phát quang (chemilluminescense) nhờ một chất phát quang Ethidium bromide; Thông thường sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agaroses 1,5 % có chứa 0,05 % Ethidium bromide chạy trong điện trường 100 V/40- 60 phút Ethidium bromide được gắn xen giữa các base của axit nucleic trong quá trình chạy điện di