Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học

Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu bạch cầu tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Vật liệu và điều kiện cơ sở vật chất để thực hiện nghiên cứu

Máu toàn phần hoặc tế bào hồng cầu từ Ngân hàng máu của Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM được sử dụng để tách hồng cầu và huyết tương, từ đó chuyển đổi thành huyết thanh.

Máu động vật được sử dụng để tách tế bào hồng cầu từ máu ngỗng, gà và vịt nhằm tạo ra mẫu bạch cầu giả định Bên cạnh đó, tế bào hồng cầu từ máu dê và ngựa cũng được tách ra để tạo mẫu tiểu cầu giả định.

Chất kháng khuẩn (Neomycin sulfate, Chloramphenicol), kháng nấm (Ketoconazol, Griseofulvin, Clotrimazol), các dung môi ổn định tế bào máu.

Trang thiết bị và cơ sở vật chất

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Model Nhà sản xuất

1 Kính hiển vi quang học CX41 Olympus – Nhật

2 Tủ an toàn sinh học cấp II SC2 – 4A1 Esco – Singapore

3 Máy đo quang UVS – 2700 Labomed – Mỹ

4 Máy phân phối mẫu tự động Dose It P910 Integra – Thụy Sĩ

5 Máy lắc ổn nhiệt SI 500 Stuart – Anh

6 Nồi hấp tiệt trùng KT – 30L ALP – Nhật

7 Tủ sấy TC – 400 Savislab – Thụy Sỹ

8 Tủ ấm IC 240 Savislab – Thụy Sỹ

9 Tủ ấm CO2 2406 – 2 Shellab – Mỹ

10 Cân điện tử 4 số ML204 Mettler Toledo – Thụy Sĩ

11 Máy đếm khuẩn lạc 8500 Funker Gerber – Đức

13 Máy đếm huyết học tự động ABX Micros60 Horiba - Pháp

Hình 2.1 Trang thiết bị thực hiện nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các thử nghiệm trên hồng cầu người và máu động vật để lựa chọn nguồn nguyên liệu phù hợp Sau khi xác định được nguyên liệu, quá trình so sánh nhiều lô mẫu tại các thời điểm khác nhau sẽ diễn ra nhằm xác định độ đồng nhất và độ ổn định, từ đó chế tạo mẫu sinh phẩm đạt tiêu chuẩn quy ước Mỗi nội dung nghiên cứu đều áp dụng các phương pháp thích hợp, đảm bảo độ lặp lại, độ tin cậy, xác thực và tính hợp lý.

Chuyên đề 1: Nghiên cứu dung dịch bảo quản mẫu hồng cầu

2.4.1.1 Lựa chọn dung dịch bảo quản

Dựa trên kết quả nghiên cứu từ đề tài "Nghiên cứu sản xuất mẫu ngoại kiểm sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm Định nhóm máu", nhóm nghiên cứu đã sử dụng dung dịch Alsever có bổ sung glycerol (ASG) để bảo quản hồng cầu, với thành phần công thức được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Thành phần môi trường ASG

Tên thành phần Hàm lượng

Nước cất vừa đủ 1000 ml

Tiệt trùng dung dịch ở 121 o C , 15 phút, 1atm

Tuy nhiên tỉ lệ thành phần tế bào hồng cầu trong dung dịch chiếm khoảng 40 –

Trong nghiên cứu, nhóm nghiên cứu đã phát hiện rằng 45% dung dịch chứa hồng cầu dùng trong xét nghiệm định nhóm máu có tỷ lệ tế bào hồng cầu bị tiêu huyết cao, dẫn đến sự thay đổi về màu sắc và số lượng tế bào Để khắc phục tình trạng này, họ đã tiến hành thử nghiệm cố định tế bào nhằm gia tăng tính bền của bề mặt tế bào, giảm tỷ lệ tiêu huyết và ổn định số lượng tế bào hồng cầu trong dung dịch, theo tài liệu hướng dẫn của WHO 98.4.

2.4.1.2 Cố định tế bào hồng cầu a Thu thập mẫu hồng cầu

Khối hồng cầu được thu thập từ ngân hàng máu của Bệnh viện Truyền máu Huyết học đã trải qua quy trình sàng lọc kỹ lưỡng để loại bỏ các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm như HIV, HBs-Ag, HCV, HTLV, KTBT, giang mai và sốt rét Máu được bảo quản trong túi chứa chất bảo quản và được thu nhận gần với thời điểm thực hiện để đảm bảo độ tươi của tế bào hồng cầu.

Khối hồng cầu được chiết ra và bổ sung dung dịch đệm đẳng trương PBS để hạn chế sự biến tính của tế bào Chúng chứa chất bảo quản với thời gian bảo quản khoảng 35 ngày Để kéo dài thời gian bảo quản, các tế bào này cần được cố định nhằm hạn chế sự dung giải tế bào.

Hồng cầu trong đệm PBS được cố định bằng glycerol, ethylene glycol, formaldehyde và glutaraldehyde, cùng với kháng sinh neomycin sulfate Hỗn hợp này được lắc nhẹ trên máy lắc trong 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng và để qua đêm ở nhiệt độ 2 – 8 độ C Sau đó, loại bỏ dịch nổi và thu nhận dịch lắng, đây chính là hồng cầu đã được cố định tế bào Cuối cùng, bổ sung dung dịch bảo quản ASG vào dịch lắng cho đến khi thể tích đạt 100 ml.

Hỗn hợp thuốc thử cố định hồng cầu gồm: formaldehyde, glutaraldehyde, trisodium citrate và nước cất được pha theo tỷ lệ sau:

Bảng 2.3 Thành phần môi trường cố định tế bào hồng cầu [17]

Tên thành phần Hàm lượng

Để xác định tuổi thọ tối đa của mẫu hồng cầu sau khi cố định trong dung dịch bảo quản ASG, cần thực hiện đánh giá độ đồng nhất ngay sau khi phân phối vào từng lọ và theo dõi độ ổn định số lượng tế bào định kỳ mỗi 5 ngày.

2.4.2 Phương pháp đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định

Mẫu bảo quản hồng cầu sau cố định được đánh giá về độ đồng nhất và độ ổn định dựa trên các hướng dẫn kiểm tra của ISO 13528 và tiêu chuẩn ISO Guide 80:2014, ILAC G13, và Guide 35 Việc kiểm tra mức độ đạt của mẫu được thực hiện thông qua hai chỉ tiêu chính: độ đồng nhất giữa các lọ mẫu kiểm tra và độ ổn định của các lô mẫu theo thời gian.

Lấy mẫu ngẫu nhiên 10% cho mỗi lô trong từng lượt kiểm tra, với mỗi mẫu được lặp lại 3 lần Các mẫu được ổn định ở nhiệt độ phòng và được đảo nhẹ trước khi đo số lượng bằng máy đếm tự động.

Tính toán độ đồng nhất bằng các chỉ số thống kê sau:

- Sử dụng phương pháp kiểm định F-test trong Anova để đánh giá độ đồng nhất

So sánh giữa giá trị Fthực nghiệm và Flý thuyết

Với : Y i là trung bình mẫu trong nhóm thứ i ( i ij i n

Y   Y ) n i là số lượng mẫu quan sát trong nhóm thứ i

Y là trung bình của tổng dữ liệu ( a

Y ij là giá trị quan sát thứ j trong nhóm thứ i của K nhóm

N là tổng cỡ mẫu quan sát

- Flý thuyết : tra bảng phân phối F với giá trị có [(K-1), bậc tự do (N-K)], mức ý nghĩa α=0,05

 Nếu Fthực nghiệm, Flý thuyết< 1 : Fthực nghiệm > Flý thuyết thì mẫu đồng nhất và ngược lại Fthực nghiệm < Flý thuyết thì mẫu không đồng nhất

 Nếu Fthực nghiệm, Flý thuyết> 1 : Fthực nghiệm < Flý thuyết thì mẫu đồng nhất và ngược lại Fthực nghiệm > Flý thuyết thì mẫu không đồng nhất

Kiểm định “t” được sử dụng để đánh giá độ ổn định của mẫu trong quá trình thực nghiệm ở nhiệt độ 2 – 8 độ C, cho đến khi số lượng hồng cầu giảm đáng kể hoặc mẫu không còn xác định được giá trị, dẫn đến tình trạng mẫu hỏng hoặc tán huyết hoàn toàn.

Tính thống kê tthực nghiệm: tthực nghiệm =  

Nồng độ trung bình của mẫu sau thời gian lưu trữ được xác định cho lô 1 (x1) và lô 2 (x2), với cỡ mẫu lần lượt là n1 và n2.

- tlý thuyết : tra bảng phân phối t được giá trị có(n1+n2-2) bậc tự do, mức ý nghĩa α0,05

 Nếu tthực nghiệm< tlý thuyết : mẫu ổn định

 Nếu tthực nghiệm> tlý thuyết : mẫu không ổn định

- Tính xác suất của giá trị thống kê t: sử dụng phần mềm Excel để tính xác suất của giá trị thống kê t:

 nồng độ trung bình của mẫu sau thời gian lưu trữ (lô 1)

 nồng độ trung bình của mẫu sau thời gian lưu trữ (lô 2)

2.4.3 Phương pháp lấy mẫu kiểm tra

Để kiểm tra chất lượng, cần lấy 10% mẫu từ lô bằng phương pháp ngẫu nhiên Phương pháp này được thực hiện bằng cách đánh số thứ tự các ống trong lô theo thứ tự từ nhỏ đến lớn (theo hàng dọc hoặc hàng ngang) và sử dụng phần mềm Microsoft Excel để chọn mẫu ngẫu nhiên.

2.4.4 Phương pháp phân tích tế bào [12], [18]

Số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu được phân tích trên máy đếm tế bào tự động ABX Micros 60 theo nguyên tắc điện trở kháng

Phương pháp điện trở kháng dựa trên sự biến đổi điện trở của khe chuẩn hóa ngâm trong chất điện phân, khi có dòng điện không đổi chạy qua từ hai điện cực Một môi trường chân không được tạo ra bên một phía của khe để cho phép các tế bào di chuyển qua Thể tích vật lý của các tế bào này tỷ lệ nghịch với dòng điện, và một xung điện được ghi lại ở đầu ra của điện cực.

Phương pháp trở kháng được sử dụng để đo lường thể tích của tế bào, bao gồm các tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, với 16 của xung điện tương ứng với kích thước của từng loại tế bào.

Mẫu dung dịch được hút và pha loãng trong dung dịch điện phân theo 1 tỷ lệ nhất định Sau đó được dẫn vào buồng đếm

Cấu tạo buồng đếm bao gồm hai buồng đếm: bạch cầu, hồng cầu

- Buồng đếm bạch cầu sẽ có nhiệm vụ đo bạch cầu và HGB

- Buồng đếm hồng cầu nhận nhiệm vụ đo hồng cầu và tiểu cầu, phân biệt dựa vào kích thước

Khi đo lường RBC, WBC và PLT, máy sử dụng phương pháp điện trở kháng thông qua một khe đếm hình tròn với hai điện cực âm và dương Khi các tế bào đi qua khe đếm, chúng tạo ra dòng điện giữa hai điện cực Kích thước của tế bào sẽ ảnh hưởng đến biến trở trong mạch, dẫn đến sự thay đổi điện áp giữa các điện cực Dựa vào mức độ thay đổi điện áp này, máy tính sẽ xác định được số lượng RBC, WBC và PLT.

Chuyên đề 2: Nghiên cứu vật liệu thay thế và chế tạo mẫu tiểu cầu giả định

2.5.1.1 Lựa chọn vật liệu thay thế tiểu cầu

Tiểu cầu là một trong ba thành phần tế bào của máu, có kích thước từ 2 – 4 μm và hình dạng đĩa dẹp Số lượng tiểu cầu trong máu người bình thường dao động từ 150 - 450 x 10^9/l; khi số lượng này thay đổi, có thể là dấu hiệu của các bệnh lý.

Tiểu cầu trưởng thành trong cơ thể người có chu kỳ tồn tại khoảng 9-10 ngày Tuy nhiên, khi được chiết tách, tiểu cầu chỉ sống từ 24 giờ đến 5 ngày, tùy thuộc vào điều kiện thu thập, và trong hệ thống mở, thời gian sống tối đa chỉ là 4 giờ Do đó, việc bảo quản và sử dụng tiểu cầu trong các mẫu kiểm chuẩn cho thiết bị phân tích và đếm tế bào tự động gặp nhiều khó khăn.

Nghiên cứu về tế bào hồng cầu ở các động vật móng guốc như bê, cừu, dê, ngựa và chó cho thấy kích thước hồng cầu ở dê dao động từ 3,09 đến 3,60 μm, với trung bình là 3,39 μm, là kích thước nhỏ nhất so với các loài động vật khác.

Vì vậy nhóm nghiên cứu hướng đến thu thập và thử nghiệm trên đối tượng là hồng cầu dê để nghiên cứu chế tạo tiểu cầu giả định

2.5.1.2 Điều chế tế bào tiểu cầu giả định (hồng cầu dê) a Thu thập mẫu hồng cầu dê

Dê nuôi tại nông trại gia súc xã Bình Mỹ, huyện Củ Chi, TPHCM, có độ tuổi từ 1,5 năm trở lên sẽ được lựa chọn để lấy mẫu máu toàn phần.

Dung dịch máu dê được lưu trữ trong chai Duran 500ml đã tiệt trùng, có chứa chất chống đông CPDA-1 Để đảm bảo chất lượng, mẫu máu sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm tại TTKCXN và bảo quản ở nhiệt độ từ 2 đến 8 độ C trước khi tiến hành phân tích hồng cầu dê.

Máu toàn phần dê được thu thập và phân tích bằng máy huyết học tự động, đồng thời được quan sát dưới kính hiển vi để xác định nồng độ và hình thái của các tế bào máu trước khi tiến hành xử lý mẫu Việc điều chế tế bào tiểu cầu giả định là bước quan trọng trong quá trình này.

Máu toàn phần dê được ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 15 phút để tách hồng cầu và huyết tương Sau đó, dịch lắng hồng cầu được thu nhận và loại bỏ huyết tương Cuối cùng, hồng cầu lắng được rửa ba lần bằng đệm đẳng trương PBS để đạt được hồng cầu sạch.

Quá trình điều chế hồng cầu người bao gồm việc sử dụng dịch hồng cầu rửa, hay còn gọi là tế bào tiểu cầu giả định, được cố định bằng đệm PBS, glutaraldehyde 25% và ethylenglycol 3%, cùng với kháng sinh neomycin sulfate Hỗn hợp này cần được trộn đều trên máy lắc trong 18 giờ ở nhiệt độ 37 độ C Sau đó, tiến hành ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 15 phút để thu nhận dịch lắng, và dịch lắng này được rửa bằng nước cất từ 2 đến 3 lần.

Khi mẫu trong không còn màu đỏ tán huyết, quá trình dừng lại Dịch tế bào tiểu cầu giả định đã được cố định hoàn toàn và bảo quản trong nước muối sinh lý NaCl 0,85% Để đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu tiểu cầu trong NaCl 0,85%, cần xác định tuổi thọ tối đa của mẫu bằng cách kiểm tra độ đồng nhất ngay sau khi phân phối vào từng lọ và theo dõi sự ổn định số lượng tế bào định kỳ mỗi 5 ngày.

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm PBS Tên dung dịch Thành phần Hàm lượng pH

Nước cất 1 lít 9,0 Đệm phosphate Dung dịch A 16 ml

Chuyên đề 3: Nghiên cứu vật liệu thay thế và chế tạo mẫu bạch cầu giả định

2.6.1.1 Lựa chọn vật liệu thay thế tế bào bạch cầu

Tế bào bạch cầu trong máu người là các tế bào có nhân, với sự đa dạng về hình dạng và kích thước, thường dao động từ 10 đến 15 micromet, tùy thuộc vào loại bạch cầu Hình dạng của các loại tế bào bạch cầu có thể được quan sát dưới kính hiển vi, thể hiện sự phong phú trong cấu trúc của chúng.

Hình 2.2 Mô hình tế bào bạch cầu trong mẫu máu toàn phần

Số lượng tế bào bạch cầu trong máu của người khỏe mạnh dao động từ 4-12 x 10^9/L Tuy nhiên, trong các trường hợp bệnh lý, con số này có thể giảm xuống dưới 4 x 10^9/L hoặc tăng lên trên 12 x 10^9/L.

Tế bào bạch cầu trong máu chỉ tồn tại bên ngoài cơ thể người từ 6 đến 9 ngày, do đó không thể sử dụng chúng để bảo quản và kiểm tra số lượng tế bào bạch cầu trong các mẫu xét nghiệm Điều này gây khó khăn trong việc đối chiếu hoặc làm chuẩn cho phân tích công thức máu, ảnh hưởng đến việc chẩn đoán các bệnh lý.

Hồng cầu ngỗng là tế bào có hình dạng trứng dẹp với kích thước trung bình từ 12 đến 14 µm và chứa nhân ở giữa Số lượng hồng cầu trung bình ở ngỗng 4 tháng tuổi đạt khoảng 2,06 ± 0,08 x 10^12 /L Kích thước hồng cầu của ngỗng có thể được so sánh với các loài động vật khác, như được minh họa trong hình sau.

Hình 2.3 Kích thước tế bào hồng cầu trong máu động vật các loài khác nhau

2.6.1.2 Điều chế tế bào bạch cầu giả định (hồng cầu ngỗng) a Thu thập mẫu hồng cầu ngỗng

Ngỗng nuôi tại nông trại gia súc xã Bình Mỹ, huyện Củ Chi, TP.HCM, từ 5 tháng tuổi trở lên sẽ được chọn để thực hiện lấy mẫu máu toàn phần.

Do lượng máu ngỗng rất ít và khó thu thập, mỗi lần thu thập sử dụng ống falcon 50ml tiệt trùng có chứa chất chống đông CPDA-1 Để đảm bảo chất lượng, mẫu máu được đưa về phòng thí nghiệm tại TTKCXN và bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 độ C trước khi tiến hành phân tích hồng cầu ngỗng.

Máu toàn phần ngỗng được tách thành phần dịch nổi và phần cặn lắng chứa tế bào máu Tế bào này được phết lam và nhuộm bằng dung dịch Wright-Giemsa, sau đó quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại X1000 để điều chế tế bào bạch cầu giả định.

Máu ngỗng được ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 15 phút để tách biệt hồng cầu và huyết tương Sau đó, dịch lắng hồng cầu được thu nhận và huyết tương được loại bỏ Để thu được hồng cầu sạch, dịch lắng hồng cầu được rửa ba lần bằng đệm đẳng trương PBS.

Dịch hồng cầu rửa, hay còn gọi là tế bào bạch cầu giả định, được cố định bằng dung dịch glutaraldehyde và bổ sung kháng sinh neomycin sulfate Hỗn hợp này được khuấy nhẹ trong 1 giờ, sau đó ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 15 phút để thu nhận dịch lắng Dịch lắng được rửa bằng nước cất từ 2 đến 3 lần cho đến khi mẫu trong và không còn màu đỏ tán huyết Tế bào bạch cầu giả định này được bảo quản trong dung dịch NaCl 0,85% Để đánh giá độ đồng nhất và ổn định, tiến hành kiểm tra tuổi thọ tối đa của mẫu trong NaCl 0,85% và theo dõi định kỳ số lượng tế bào mỗi 5 ngày.

Chuyên đề 4: Khảo sát môi trường để tổ hợp các thành phần tế bào hồng cầu người, hồng cầu động vật dùng thay thế tiểu cầu, hoặc bạch cầu

cầu người, hồng cầu động vật dùng thay thế tiểu cầu, hoặc bạch cầu

2.7.1.1 Khảo sát lựa chọn môi trường tổ hợp các tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào hồng cầu người và động vật cần đảm bảo ổn định về số lượng và chất lượng để thay thế tiểu cầu và bạch cầu Dung dịch môi trường chung phải chứa các thành phần thiết yếu để duy trì sự sống và chức năng của các tế bào máu.

Hồng cầu bán cố định được bảo quản trong dung dịch ASG, với số lượng tế bào nằm trong khoảng giá trị ngưỡng bình thường của mẫu.

Bạch cầu giả định, được chiết xuất từ hồng cầu ngỗng, đã được cố định và bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý, là thành phần thứ hai trong nghiên cứu này.

Tiểu cầu giả định, được chiết xuất từ hồng cầu dê đã được cố định, được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý.

Dung dịch nền là thành phần quan trọng trong việc bảo quản tế bào máu, giúp duy trì độ đồng nhất và ổn định của các tế bào Để đảm bảo sự ổn định trong thời gian bảo quản, dung dịch nền cần phải đẳng trương, nhằm giảm thiểu sự tiêu huyết của tế bào hồng cầu Việc này hỗ trợ trong việc theo dõi và đo lường số lượng tế bào thông qua máy đếm tự động.

Các môi trường dung dịch như ASG và nước muối sinh lý là đối tượng nghiên cứu chính trong việc bảo quản tế bào Tuy nhiên, việc khảo sát thêm các loại dung dịch khác, như nước dừa, cũng rất quan trọng Nước dừa chứa nhiều yếu tố vi lượng và muối khoáng, có khả năng ổn định tế bào nhờ tính đẳng trương của nó.

Huyết tương trong máu có chức năng duy trì trạng thái lỏng, giúp lưu thông máu dễ dàng và giữ pH ở mức kiềm nhẹ (khoảng 7,3) Thành phần chính của huyết tương là nước (90%), trong khi 10% còn lại bao gồm các chất tan như hợp chất hữu cơ, muối vô cơ và protein huyết tương (albumin, globulin, và các yếu tố đông máu) Để bảo quản tế bào máu, huyết tương cần được tách bỏ các yếu tố đông máu, tạo thành huyết thanh.

Do đó, các dung dịch được lựa chọn cho nghiên cứu này là nước dừa, nước muối sinh lý (NaCl) 0,85%, ASG và huyết thanh

Hình 2.4 Mô hình biểu diễn sự tổ hợp các tế bào máu

2.7.1.2 Khảo sát thời gian bảo quản mẫu tổ hợp các tế bào máu

Mẫu tổ hợp tế bào máu được bảo quản trong huyết thanh với tỷ lệ 1:1, bao gồm 48 hồng cầu, 1 bạch cầu giả định và 1 tiểu cầu giả định Thời gian bảo quản mẫu được xác định dựa trên độ đồng nhất và sự ổn định của số lượng tế bào máu.

2.7.1.3 Khảo sát sức bền các tế bào hồng cầu [7]

Mẫu tổ hợp 03 loại tế bào hồng cầu (hồng cầu người, hồng cầu dê, hồng cầu ngỗng) đều có đặc điểm chung là cùng một loại tế bào Trong quá trình điều chế, các tế bào hồng cầu này đã được cố định để hạn chế sự dung giải Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm sức bền hồng cầu nhằm khảo sát sự thay đổi của tế bào trước và sau khi cố định.

Sức bền của 03 loại tế bào hồng cầu này được khảo sát trong môi trường NaCl có nồng độ từ 0,6 – 0,26%

2.7.2 Phương pháp chuyển đổi dung dịch huyết tương thành huyết thanh [25],

Giai đoạn 1: Điều chế dung dịch Kaolin- CaCl 2

Hòa tan 10g CaCl2.2H2O và 1 g MgCl2.6H2O trong 400ml nước cất

Hòa 5g Kaolin trong 100ml nước cất, sau đó cho hai hỗn hợp trên trộn đều nhau, ta có hỗn hợp dung dịch Kaolin-CaCl2 Bảo quản dung dịch ở 2-8 0 C

Giai đoạn 2: Chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh

Huyết tương được làm ấm đến 37 độ C, sau đó thêm 1ml hỗn hợp dung dịch Kaolin-CaCl2 vừa mới điều chế vào 100ml huyết tương Cuối cùng, bổ sung thêm 0,1g sodium azide vào 100ml huyết tương này.

Trộn đều hỗn hợp trên máy khuấy từ cho đến khi hình thành cục đông, khuấy tiếp tục trong vòng 1 giờ Để hỗn hợp qua đêm ở nhiệt độ 4 0 C

Thu nhận dịch nổi, lọc thô huyết thanh qua màng lọc acetate, sau đó lọc vô trùng qua màng lọc 0,45 μm Bảo quản ở 2-8 0 C.

Chuyên đề 5: Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến số lượng các tế bào máu…

2.8.1 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng

Môi trường bảo quản tế bào máu có nhiều thành phần với tỷ lệ khác nhau Để tối ưu hóa tỷ lệ các chất bảo quản ảnh hưởng đến số lượng tế bào máu, cần tiến hành thử nghiệm sàng lọc các yếu tố quan trọng nhất.

Mẫu sinh phẩm dùng để đo số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu trong xét nghiệm huyết học lâm sàng cần có thời gian bảo quản dài, tối ưu là 3 tháng, để đảm bảo phòng xét nghiệm thực hiện xét nghiệm và Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Thành phố có đủ thời gian triển khai mẫu cho các đơn vị tham gia chương trình ngoại kiểm trên toàn quốc Nhiệt độ bảo quản được khuyến nghị là từ 2 đến 8 độ C.

Nồng độ các tế bào máu được duy trì ở mức bình thường với số lượng hồng cầu từ 3,5 – 4,5 x 10^12/L, bạch cầu từ 4,5 – 8,5 x 10^9/L và tiểu cầu từ 150 – 250 x 10^9/L Để hạn chế sự tán huyết của tế bào hồng cầu người và đảm bảo sự ổn định của các tế bào máu trong quá trình bảo quản và vận chuyển, môi trường được bổ sung kháng sinh kháng khuẩn neomycin sulfate, kháng nấm chloramphenicol, Sodium azide NaN3 và tá dược phù hợp.

Bảng 2.5 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman của mẫu có nồng độ bình thường

STT Tên yếu tố Mức dưới (-1) Mức trên (+1)

2.8.2 Phương pháp ma trận Plackett-Burman

Phương pháp này được thực hiện để khảo sát và lựa chọn môi trường thích hợp để tổ hợp các tế bào máu

Mục tiêu của nghiên cứu là xác định yếu tố thí nghiệm có ảnh hưởng lớn nhất đến chỉ tiêu theo dõi, từ đó loại bỏ các yếu tố không cần thiết Kết quả thu được từ thí nghiệm này sẽ được sử dụng để tối ưu hóa các yếu tố thí nghiệm theo phương pháp RSM – CCD.

Thiết kế Plackett – Burman là phương pháp lý tưởng cho các thí nghiệm với từ 2 đến 31 yếu tố, mỗi yếu tố có hơn hai cấp độ khác nhau Phương pháp này được áp dụng khi giả định rằng không có sự tương tác giữa hai yếu tố, nhằm kiểm tra độ tin cậy trong việc loại bỏ các yếu tố có ảnh hưởng rất nhỏ hoặc không có ảnh hưởng đến chỉ tiêu theo dõi Kết quả thu được sẽ xác định các yếu tố có tác động lớn nhất đến chỉ tiêu theo dõi.

Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo thiết kế Plackett – Burman được xây dựng với n + 1 thí nghiệm khác nhau, trong đó n có thể là 11, 19, 23, 27 hoặc 31 Các yếu tố tác động trong ma trận này được thiết lập ở hai mức độ: thấp (-1) và cao (+1), như thể hiện trong bảng 2.5.

Các yếu tố tác động đến sự thay đổi số lượng của các tế bào được khảo sát là:

- Dung dịch nền ổn định tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu

- Chất kháng khuẩn, kháng nấm, NaN3 và tá dược

Kết quả nghiên cứu được phân tích bằng chương trình “Design expert®7.0”, Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA.

Chuyên đề 6: Tối ưu hóa thành phần dung dịch chứa các tế bào máu

2.9.1 Thí nghiệm tối ưu hoá thành phần các chất trong môi trường bảo quản

Dựa trên kết quả từ thí nghiệm sàng lọc Plackett – Burman, nhóm nghiên cứu đã tiến hành quy hoạch thực nghiệm và xác định phương án tối ưu nhất đáp ứng các điều kiện đã đề ra Phương pháp quy hoạch thực nghiệm áp dụng là phương pháp hàm bề mặt đáp ứng với thiết kế cấu trúc có tâm (RSM – CCD).

2.9.2 Đánh giá mô hình thực nghiệm

Dựa trên kết quả tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD, nhóm nghiên cứu đã xác định phương án tối ưu nhất cho môi trường bảo quản tế bào máu và tiến hành đánh giá lại mô hình thông qua thực nghiệm.

2.9.3 Phương pháp tối ưu hoá Response Surface Methodology – Central

Phương pháp bề mặt đáp ứng là một kỹ thuật mô hình thực nghiệm quan trọng để đánh giá mối quan hệ giữa các yếu tố thử nghiệm kiểm soát Kỹ thuật này dựa trên kết quả kiểm tra biến, nhằm xác định các biến thử nghiệm cần thiết cho việc bảo quản tế bào máu một cách tối ưu Để thực hiện điều này, phương pháp sử dụng thiết kế Central Composite và phương pháp Response Surface.

Nghiên cứu này nhằm xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố chính từ kết quả sàng lọc, được phân tích ở 5 mức khác nhau trong thiết kế thí nghiệm CCD với tổng cộng 20 thí nghiệm theo công thức 2n + 2n + 6 Ma trận quy hoạch thực nghiệm được xây dựng dựa trên phương pháp bề mặt đáp ứng, bao gồm 8 thí nghiệm với 3 yếu tố ở mức thấp và cao Sau đó, thực hiện thêm 6 thí nghiệm ở cánh tay đòn α và 6 thí nghiệm còn lại ở mức trung tâm.

Bảng 2.6 Bố trí 20 thí nghiệm theo CCD

Nồng độ tế bào máu ( x 10 9 /L)

Bạch cầu (Hồng cầu ngỗng)

Tiểu cầu (Hồng cầu dê)

Hàm đáp ứng được chọn là số lượng hồng cầu người (Y1, A x 10 9 /L), hồng cầu ngỗng (thay thế bạch cầu, Y2, B x 10 9 /L) và hồng cầu dê (thay thế tiểu cầu, Y3, C x

10 9 /L), trong đó A, B, C là số lượng các tế bào máu đo được sau thời gian bảo quản 3 tháng ở 2 – 8 0 C, mô hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc 2:

Trong đó, b1, b2, b3 là các hệ số bậc 1; b11, b22, b33 là các hệ số bậc 2; b12, b23, b13 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố; x1, x2, x3, x11, x22, x33, x12, x23, x13 là các biến độc lập

Số liệu được phân tích bằng phần mềm "Design Expert® 7.0" của Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA Kết quả phân tích cho phép xác định mức tối ưu của các yếu tố nhằm đạt được nồng độ tế bào máu tối đa.

Chuyên đề 7: Khảo sát tuổi thọ của mẫu trong điều kiện bảo quản 2-8 0 C và trong điều kiện vận chuyển

trong điều kiện vận chuyển

Mẫu tổ hợp tế bào máu có thời gian sử dụng tối đa 3 tháng sau khi được bổ sung các thành phần trong môi trường tối ưu theo chuyên đề 6 Thời hạn sử dụng này được nghiên cứu và xác định trong điều kiện bảo quản lạnh từ 2-8 độ C tại phòng xét nghiệm của Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM.

29 kiện vận chuyển sẽ được gửi đến một phòng xét nghiệm để xác định số lượng tế bào máu ngay trong ngày nhận mẫu Kết quả sẽ được gửi về cho nhóm nghiên cứu để tiến hành phân tích.

Phương pháp kiểm định t được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa mẫu tổ hợp tại phòng xét nghiệm của TTKCXN và phòng xét nghiệm đối chiếu Việc so sánh từng cặp số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu được thực hiện thông qua tính toán bằng phần mềm Excel.

Giả thiết H0 cho rằng hai lô mẫu từ hai phòng xét nghiệm có nồng độ tương đồng, trong khi giả thiết H1 chỉ ra rằng hai lô mẫu này có nồng độ không tương đồng Mức ý nghĩa được thiết lập là α = 0,05.

Chuyên đề 8: Xác định giá trị tối thiểu số lượng các loại tế bào máu trong môi trường tối ưu

Mẫu ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm Huyết học cần đáp ứng nhiều mức nồng độ khác nhau Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát để tìm ra các công thức tối ưu cho mẫu có nồng độ thấp nhất và cao nhất.

Thí nghiệm được lặp lại giống với thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng ở mẫu có nồng độ bình thường (bảng 2.7)

Dựa trên kết quả mẫu nội kiểm huyết học ABX Minitrol 16 (số lô MX 402 và

Nhóm nghiên cứu đã xác định ngưỡng nồng độ thấp nhất cho mẫu nghiên cứu MX 056 ở ba mức: thấp, bình thường và cao, với số lượng hồng cầu từ 2 – 3,5 x 10^12/L, bạch cầu từ 2,0 – 4,5 x 10^9/L và tiểu cầu từ 90 – 150 x 10^9/L Các nồng độ này được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong ma trận Placket-Burman và tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD Mẫu được bảo quản trong 3 tháng ở nhiệt độ 2 – 8 °C.

Bảng 2.7 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman của mẫu có nồng độ thấp

2.11.2 Thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp RSM-CCD

Dựa trên kết quả từ thí nghiệm sàng lọc Plackett – Burman, nhóm nghiên cứu đã tiến hành quy hoạch thực nghiệm và tìm ra phương án tối ưu nhất đáp ứng các điều kiện đã đề ra Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được áp dụng là phương pháp hàm bề mặt đáp ứng với thiết kế cấu trúc có tâm (RSM – CCD).

Dựa trên kết quả tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD, nhóm nghiên cứu đã chọn phương án tối ưu nhất cho việc bảo quản tế bào máu và tiến hành đánh giá lại mô hình thông qua thực nghiệm.

2.12 Chuyên đề 9: Xác định giá trị cực đại số lượng các loại tế bào máu trong môi trường tối ưu

Thí nghiệm được lặp lại giống với thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng ở mẫu có nồng độ thấp nhất (bảng 2.8)

MX 056) ở 3 mức nồng độ: thấp, bình thường và cao, nhóm nghiên cứu xây dựng

Nghiên cứu xác định ngưỡng nồng độ cao nhất cho các mẫu với số lượng hồng cầu từ 4,5 – 5,5 x 10^12/L, bạch cầu từ 8,5 – 30 x 10^9/L và tiểu cầu từ 250 – 500 x 10^9/L Các nồng độ này được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong ma trận Placket-Burman và tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD Mẫu được bảo quản cố định trong 3 tháng ở nhiệt độ từ 2 – 8 độ C.

Bảng 2.8 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman của mẫu có nồng độ cao

2.12.2 Thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp RSM-CCD

Dựa trên các thí nghiệm nghiên cứu với nồng độ thấp và bình thường, nhóm nghiên cứu đã thực hiện quy hoạch thực nghiệm sau khi phân tích kết quả từ thí nghiệm sàng lọc Plackett – Burman Kết quả thu được cho thấy phương án tối ưu nhất đáp ứng các điều kiện đã đề ra Phương pháp quy hoạch thực nghiệm áp dụng là hàm bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm (RSM – CCD).

Dựa trên kết quả tối ưu hóa từ phương pháp RSM-CCD, nhóm nghiên cứu đã chọn ra phương án tối ưu nhất cho môi trường bảo quản tế bào máu và tiến hành đánh giá lại mô hình thông qua thực nghiệm.

Chuyên đề 10: Xây dựng quy trình tạo mẫu sinh phẩm chuẩn dùng kiểm tra chất lượng xét nghiệm đếm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu trong Huyết học

chất lượng xét nghiệm đếm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu trong Huyết học

2.13.1 Xây dựng sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất và các bước thực hiện

Căn cứ theo các hướng dẫn của ISO Guide 34: 2000 về yêu cầu cần thiết của nhà sản xuất mẫu chuẩn [13]

2.13.2 Xây dựng nội dung kiểm tra và tiêu chí kiểm tra ở các công đoạn

Kiểm tra nguyên vật liệu đầu vào : kiểm tra theo tiêu chuẩn chất lượng của nhà sản xuất

Kiểm tra quy trình sản xuất: xác định công đoạn và nội dung kiểm tra

Kiểm tra mẫu thành phẩm: xây dựng và kiểm tra các nội dung theo qui định của tiêu chuẩn cơ sở.

Chuyên đề 11: Xác định giá trị ấn định số lượng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu của mẫu sinh phẩm theo các nhóm thiết bị

cầu của mẫu sinh phẩm theo các nhóm thiết bị

Hai loại tế bào hồng cầu là hồng cầu ngỗng và hồng cầu dê được cố định và tổ hợp với nhau ở ba mức nồng độ thấp, trung bình và cao, ký hiệu là HH1, HH2, HH3 Mười bộ mẫu, mỗi bộ gồm ba mức nồng độ, đã được đo lặp lại 10 lần trên máy ABX Micros 60 tại Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm để xác định giá trị ấn định X ± 2SD Đồng thời, mẫu cũng được gửi đến bốn phòng xét nghiệm khác sử dụng các dòng máy Mindray, CD 1700, CD 3200 và CD Ruby, tham gia chương trình ngoại kiểm huyết học Mỗi phòng xét nghiệm nhận 10 bộ mẫu để kiểm tra và gửi kết quả về TTKCXN để phân tích và xác định giá trị ấn định cho bốn dòng máy này.

Chuyên đề 12: Gửi mẫu cho PXN đối chiếu để đánh giá giá trị ấn định

Sau khi xác định giá trị ấn định số lượng tế bào máu trên từng dòng máy, mẫu tổ hợp sẽ được gửi đến 50 phòng xét nghiệm để đối chiếu Mục đích của việc này là đánh giá tác động của môi trường thực tế đối với mẫu.

Các phòng xét nghiệm được lựa chọn phải thoả các tiêu chí sau:

- Tham gia đầy đủ chương trình ngoại kiểm huyết học và không bị đánh dấu cảnh báo

- Có thực hiện phân tích xét nghiệm Huyết học trên các dòng máy đang được nghiên cứu: ABX Micros, Celldyn 1700, Mindray, Celldyn 3200 và Celldyn Ruby

Phương thức gửi mẫu tiến hành như sau:

Mỗi đơn vị sẽ nhận một bộ mẫu riêng biệt với ba mức nồng độ khác nhau, mỗi bộ mẫu bao gồm ba lọ Sau khi phân tích, các đơn vị cần gửi lại phiếu trả lời kết quả cho TTKCXN TP.HCM.

Ba thông số ở ba mức nồng độ khác nhau sẽ được gửi qua đường bưu điện trong điều kiện vận chuyển lạnh (2°C – 8°C) Quy trình gửi mẫu và trả kết quả của PXN đảm bảo bảo mật thông tin.

Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excel và đánh giá thông qua biểu đồ Levey-Jennings, thể hiện sự biến thiên của từng chỉ số hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu quanh giá trị ấn định theo từng dòng máy Số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu được xem là đạt khi thỏa mãn hai tiêu chí cụ thể.

Kết quả phân tích số lượng tế bào máu, bao gồm hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, của mỗi phòng xét nghiệm cần đạt yêu cầu lớn hơn 80% Cụ thể, mỗi phòng xét nghiệm phải cung cấp ít nhất 8 trong 9 kết quả đo lường số lượng các tế bào máu nằm trong khoảng giá trị X ± 2SD.

Số lượng phòng xét nghiệm cần đạt được để phân tích nồng độ các tế bào máu phải lớn hơn 50%, cụ thể là 6 trong tổng số 10 phòng xét nghiệm cho mỗi dòng máy.

Sử dụng phân tích two-way ANOVA kết hợp với phần mềm Excel để đánh giá sự khác biệt giữa các phòng xét nghiệm (n) trên từng loại thiết bị phân tích, cũng như so sánh giữa các thiết bị phân tích khác nhau ở cùng một mức nồng độ nhằm xác định tính đồng nhất của kết quả.

Giả thuyết H0 được đặt ra nhằm khẳng định rằng số lượng tế bào máu từ các phòng xét nghiệm trên từng thiết bị phân tích là tương đương nhau Điều này có nghĩa là kết quả phân tích số lượng tế bào máu từ các thiết bị khác nhau cũng phải giống nhau.

H0 theo cột) Nếu F1 (theo hàng) < Fk-1, (k-1)(h-1), α và F2 (theo cột) < Fh-1, (k-1)(h-1), α thì chấp nhận giả thuyết H0, ngược lại thì bác bỏ giả thuyết H0

KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

Kết quả nghiên cứu dung dịch bảo quản mẫu hồng cầu

Khối hồng cầu được chiết ra và bổ sung dung dịch đệm đẳng trương PBS để hạn chế sự biến tính của tế bào hồng cầu Chúng có chứa chất bảo quản với thời gian bảo quản khoảng 35 ngày Để kéo dài thời gian bảo quản, các tế bào này cần được cố định nhằm hạn chế sự dung giải tế bào.

Hồng cầu trong đệm đẳng trương PBS được cố định bằng glycerol, ethylene glycol, formaldehyde và glutaraldehyde, kèm theo kháng sinh neomycin sulfate Sau khi trộn đều hỗn hợp trên máy lắc trong 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng, để qua đêm ở nhiệt độ 2 – 8 độ C Tiếp theo, loại bỏ dịch nổi và thu nhận dịch lắng, đây là hồng cầu đã được cố định tế bào Cuối cùng, bổ sung dung dịch bảo quản ASG vào dịch lắng cho đến khi thể tích đạt 100 ml.

3.1.1 Kết quả đánh giá độ đồng nhất

Mẫu hồng cầu được phân phối thành 50 lọ, mỗi lọ chứa 2 ml, chia thành 2 lô với 25 lọ mỗi lô Để xác định độ đồng nhất, 10% mẫu (3 lọ) được lấy ngẫu nhiên từ mỗi lô ngay sau khi phân phối.

Giả thiết rằng H0: 𝑆 1 2 = 𝑆 2 2 là hai lô mẫu đồng nhất và H1: 𝑆 1 2 # 𝑆 2 2 là 2 lô mẫu không đồng nhất (α = 0,05)

Dựa vào kết quả đánh giá độ đồng nhất của hai lô mẫu, phân tích thống kê cho thấy giá trị thống kê thực nghiệm |𝐹𝑡ℎự𝑐 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚 | = 15,2136 nhỏ hơn giá trị lý thuyết |𝐹 𝑙ý 𝑡ℎ𝑢𝑦ế𝑡 | = 19, do đó, giả thiết H0 về sự đồng nhất trong phân phối số lượng hồng cầu vào các lọ được chấp nhận.

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ đồng nhất mẫu hồng cầu người

Lọ Số lượng hồng cầu (10 12 /L)

3.1.2 Kết quả đánh giá độ ổn định

Mẫu hồng cầu người được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 độ C sau khi phân phối vào từng lọ Mỗi 5 ngày, một lọ ngẫu nhiên từ mỗi lô sẽ được lấy ra để đánh giá độ ổn định, nhằm xác định tuổi thọ tối đa của mẫu.

Giả thiết rằng H0 à 1 = à 2 là hai lụ mẫu cú nồng độ ổn định và H1: à 1 # à 2 là 2 lụ mẫu có nồng độ không ổn định (α = 0,05)

Dựa trên kết quả đánh giá độ ổn định (bảng 3.2, hình 3.1), nhóm nghiên cứu ghi nhận sự giảm rõ rệt số lượng hồng cầu sau 90 ngày Phân tích thống kê cho thấy những kết quả này có ý nghĩa quan trọng.

Ngày bảo quản 90: |tthực nghiệm| = 2,0055 < t lý thuyết = 2,0281, (Phụ lục 1.2) do đó chấp nhận giả thiết H0: số lượng hồng cầu vẫn ổn định tại thời điểm ngày thứ 90

Vào ngày bảo quản thứ 95, giá trị thực nghiệm tthực nghiệm = 2,0737 lớn hơn t lý thuyết = 2,0244 (Phụ lục 1.2), do đó giả thiết H0 không được chấp nhận Điều này cho thấy rằng số lượng hồng cầu đã bắt đầu có sự thay đổi từ thời điểm này.

Ngày bảo quản 100 cho thấy giá trị thực nghiệm t là 2,1120, lớn hơn t lý thuyết 2,0322, do đó giả thiết H0 không được chấp nhận Số lượng hồng cầu không còn ổn định từ ngày thứ 95 và có sự giảm rõ rệt vào ngày thứ 100.

Dựa trên kết quả phân tích thống kê, nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng tế bào hồng cầu người, sau khi được cố định và bảo quản trong dung dịch ASG, có độ đồng nhất cao.

37 và thời gian bảo quản là 90 ngày (tương đương 3 tháng) với số lượng dao động từ 2,50 – 3,15 x 10 12 /L

Bảng 3.2 Kết quả độ ổn định tế bào hồng cầu trong 100 ngày bảo quản

Ngày kiểm tra Số lượng hồng cầu (10 12 /L)

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn độ ổn định số lượng hồng cầu trong 100 ngày

Sơ đồ quá trình điều chế hồng cầu người:

Khối hồng cầu Khối hồng cầu

Khuấy trộn hỗn hợp Để lắng Để lắng

Bổ sung dung lắng dịch bảo quản

Bổ sung dung dịch bảo quản

Khấy từ, nhẹ đều, 15-30 phút 2-8 o C, 8 – 12 giờ

Kháng sinh (2) : hh hồng cầu

(tỷ lệ 5 mg:100 mL) dd ASG

Xử lý cố định hồng cầu

Hồng cầu: Dd đệm: thuốc thử ổn định: ethylene glycol:glycerol

Hình 3.2 Sơ đồ điều chế mẫu hồng cầu cố định

Số lượ ng hồ ng cầ u 1012 /L

Số lượng hồng cầu sau 100 ngày bảo quản

Kết quả nghiên cứu vật liệu thay thế và chế tạo mẫu tiểu cầu giả định

3.2.1 Kết quả phân tích máu dê

- Máy huyết học tự động:

Máu toàn phần dê được phân tích trên máy huyết học ABX Micros 60, cho thấy số lượng tiểu cầu ghi nhận rất lớn, gấp 8 lần giá trị tối đa của mức tiểu cầu tự nhiên ở người.

Hồng cầu dê, khi quan sát dưới kính hiển vi, có kích thước gần giống với tiểu cầu của người, vì vậy chúng được chọn làm vật liệu thay thế cho tiểu cầu trong mẫu tổ hợp các tế bào máu Sử dụng độ phóng đại X400 và X1000 để quan sát chi tiết hơn.

Hình 3.3 Tế bào hồng cầu dê quan sát dưới kính hiển vi

Mẫu tiểu cầu giả định được phân phối vào 50 lọ, mỗi lọ chứa 2 ml và được chia thành 2 lô khác nhau, tương đương với 25 lọ mỗi lô Để xác định độ đồng nhất, 10% mẫu từ mỗi lô, tức là 3 lọ, sẽ được lấy ngẫu nhiên ngay sau khi mẫu được phân phối vào từng lọ.

Giả thiết rằng H0: S 1 2 = S 2 2 là hai lô mẫu đồng nhất và H1: S 1 2 # S 2 2 là 2 lô mẫu không đồng nhất (α = 0,05)

Dựa trên kết quả đánh giá độ đồng nhất của hai lô mẫu, phân tích thống kê cho thấy giá trị F thực nghiệm là 3, nhỏ hơn giá trị F lý thuyết là 19, do đó giả thuyết được chấp nhận.

H0: số lượng tiểu cầu giả định phân phối vào các lọ là đồng nhất (phụ lục 1.3)

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ đồng nhất mẫu tiểu cầu giả định

Lọ Số lượng tiểu cầu giả định (10 12 /L)

Mẫu tiểu cầu sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 độ C sau khi phân phối vào từng lọ Mỗi 5 ngày, một lọ sẽ được lấy ngẫu nhiên từ mỗi lô để đánh giá độ ổn định, nhằm xác định tuổi thọ tối đa của mẫu.

Giả thiết rằng H0:à 1 = à 2 là hai lụ mẫu cú nồng độ ổn định và H1: à 1 # à 2 là 2 lô mẫu có nồng độ không ổn định (α = 0,05)

Dựa trên kết quả đánh giá độ ổn định từ bảng 3.4 và hình 3.4, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng số lượng tiểu cầu sau 100 ngày không có sự thay đổi rõ rệt Phân tích thống kê cho thấy |t thực nghiệm| = 0,4899 nhỏ hơn t lý thuyết = 2,0227 (xem Phụ lục 1.4), do đó giả thiết H0 được chấp nhận.

Theo phân tích thống kê, nhóm nghiên cứu xác định rằng tế bào tiểu cầu giả định sau khi được cố định và bảo quản trong dung dịch NaCl 0,85% có độ đồng nhất cao và có thể bảo quản trong 100 ngày (tương đương 3 tháng 10 ngày) với số lượng dao động từ 10^6.

Bảng 3.4 Kết quả độ ổn định tiểu cầu giả định trong 100 ngày bảo quản Ngày kiểm tra Số lượng tiểu cầu (10 9 /L)

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn độ ổn định số lượng tế bào tiểu cầu giả định trong 100 ngày bảo quản

Sơ đồ quy trình điều chế mẫu tiểu cầu giả định:

Số lượng tiểu cầu sau 100 ngày thử nghiệm

Tách và thu nhận hồng cầu

Rửa hồng cầu Rửa hồng cầu

Trộn hỗn hợp Trộn hỗn hợp Để lắng Để lắng

Ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút, thu phần lắng Đệm PBS (pH 7,3), từ 2-3 lần dd cố định (*) : hồng cầu (tỷ lệ 0,5:10) dd NaCl 0,85%

Lắc đều, nhẹ trong 1 giờ

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình điều chế mẫu tiểu cầu giả định

Kết quả nghiên cứu vật liệu thay thế và chế tạo mẫu bạch cầu giả định

3.3.1 Kết quả phân tích máu ngỗng

- Máy huyết học tự động:

Máu toàn phần ngỗng đã được phân tích bằng máy huyết học ABX Micros 60, cho thấy số lượng bạch cầu ghi nhận rất cao, gấp 40 lần mức tối đa bình thường ở người (phụ lục 2.2).

Hồng cầu ngỗng, khi quan sát dưới kính hiển vi, có kích thước tương tự như bạch cầu của người, do đó chúng được lựa chọn làm vật liệu thay thế cho bạch cầu trong các mẫu tổ hợp tế bào máu.

Hình 3.6 Hồng cầu ngỗng sau khi nhuộm quan sát dưới kính hiển vi X1000

Mẫu bạch cầu được phân phối vào 50 lọ, mỗi lọ chứa 2 ml, và được chia thành 2 lô khác nhau (25 lọ mỗi lô) Để xác định độ đồng nhất, 10% mẫu trong mỗi lô (tương đương 3 lọ) được lấy ngẫu nhiên ngay sau khi phân phối vào từng lọ.

Giả thiết rằng H0: S 1 2 = S 2 2 là hai lô mẫu đồng nhất và H1: S 1 2 # S 2 2 là 2 lô mẫu không đồng nhất (α = 0,05)

Kết quả đánh giá độ đồng nhất của 2 lô mẫu cho thấy |Fthực nghiệm| = 6,8958 < |F lý thuyết| = 19, từ đó chấp nhận giả thiết H0 rằng số lượng bạch cầu phân phối vào các lọ là đồng nhất.

Bảng 3.5 Kết quả độ đồng nhất tế bào bạch cầu giả định

Lọ Số lượng bạch cầu (10 9 /L)

Mẫu bạch cầu giả định sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 độ C sau khi phân phối vào từng lọ Mỗi 5 ngày, một lọ sẽ được lấy ngẫu nhiên từ mỗi lô để đánh giá độ ổn định, nhằm xác định tuổi thọ tối đa của mẫu.

Giả thiết rằng H0: à 1 = à 2 là hai lụ mẫu cú nồng độ ổn định và H1: à 1 # à 2 là 2 lô mẫu có nồng độ không ổn định (α = 0,05)

Dựa trên kết quả đánh giá độ ổn định, nhóm nghiên cứu nhận thấy số lượng bạch cầu sau 100 ngày không có sự thay đổi rõ rệt Phân tích thống kê cho thấy |t thực nghiệm| = 0,9114 nhỏ hơn t lý thuyết = 2,0262, do đó giả thiết H0 được chấp nhận.

Theo phân tích thống kê, nhóm nghiên cứu xác định rằng tế bào bạch cầu giả định sau khi cố định và bảo quản trong dung dịch NaCl 0,85% có độ đồng nhất cao Thời gian bảo quản tối ưu được xác định là 100 ngày (tương đương 3 tháng 10 ngày) với số lượng tế bào dao động từ 5,27 đến 5,67 x 10^9/L.

Bảng 3.6 Kết quả độ ổn định bạch cầu giả định trong 100 ngày bảo quản

Ngày kiểm tra Số lượng bạch cầu (10 9 /L)

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn độ ổn định số lượng tế bào bạch cầu giả định trong 100 ngày bảo quản

Sơ đồ quy trình điều chế mẫu bạch cầu giả định:

Tách và thu nhận hồng cầu

Rửa hồng cầu Rửa hồng cầu

Trộn hỗn hợp Trộn hỗn hợp Ly tâm Ly tâm Thu dịch lắng Thu dịch lắng Rửa dịch lắng

Không tiêu huyết Tiêu huyết

15 phút, thu phần lắng Đệm PBS (pH 7,3), 3 lần dd glutaraldehyde 25% : hồng cầu

Lắc đều, nhẹ trong 1 giờ

Huyền dịch nồng độ 30% dd NaCl 0,85%

Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chế tạo mẫu tế bào bạch cầu giả định

Số lượ ng bạ ch cầ u 10 9 /L

Số lượng bạch cầu sau 100 ngày bảo quản

Kết quả khảo sát môi trường để tổ hợp các thành phần tế bào máu

3.4.1 Kết quả khảo sát lựa chọn dung dịch làm môi trường tổ hợp các tế bào

Thử nghiệm khảo sát 4 loại chất nền (nước dừa, NaCl 0,85%, ASG và huyết thanh) được thực hiện với tỷ lệ pha loãng 1:1 Trước khi đưa vào các môi trường bảo quản, số lượng tế bào máu được xác định là 3,31 x 10^12/L cho tế bào hồng cầu, 6,39 x 10^9/L cho tế bào bạch cầu giả định và 115 x 10^9/L cho tế bào tiểu cầu giả định Đánh giá độ ổn định của các tế bào máu trong từng loại môi trường được thực hiện bằng cách đo số lượng tế bào máu trên máy phân tích huyết học ABX Micros 60 sau mỗi 5 ngày.

Sau 5 ngày, mẫu trong chất nền nước dừa và nước muối sinh lý 0,85% NaCl cho thấy hiện tượng tiêu huyết rõ rệt, trong khi các tế bào trong dung dịch ASG vẫn bị tiêu huyết một phần so với huyết thanh Số lượng tế bào hồng cầu người đo được trong hai loại môi trường này thấp hơn.

1 x 10 12 /L, trong dung dịch ASG là 2,82 x 10 12 /L và trong dịch huyết thanh là 3,20 x

Để bảo quản tổ hợp ba loại tế bào máu, cần sử dụng một dung môi có độ nhớt cao nhằm hạn chế va chạm giữa tế bào hồng cầu và các tế bào bạch cầu, tiểu cầu Dựa trên kết quả thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã quyết định chọn huyết thanh làm dung dịch nền để bảo quản mẫu tổ hợp.

Hình 3.9 Môi trường bảo quản các tế bào máu sau 5 ngày

Bạch cầu giả định (b) Đo số lượng tế bào Đo số lượng tế bào

Tách và thu nhận tế bào

Rửa tế bào Rửa tế bào

Trộn hỗn hợp Trộn hỗn hợp

15 phút, thu phần lắng Đệm PBS (pH 7,3), từ 2-3 lần

Trộn (a), (b), (c), (d) theo tỷ lệ thích họp

Hồng cầu người (a) Tiểu cầu giả định (c)

Tiểu cầu giả định (c) DD huyết thanh (d)

Kháng sinh : hh hồng cầu

Mẫu sinh phẩm đo số lượng HC,

BC, TC Đo số lượng tế bào Đo số lượng tế bào

Rửa tế bào Rửa tế bào Đo số lượng tế bào Đo số lượng tế bào

Rửa tế bào Rửa tế bào

Hình 3.10 Sơ đồ phối trộn tổ hợp các thành phần tế bào máu

3.4.2 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản mẫu tổ hợp các tế bào máu

Dựa trên kết quả thử nghiệm thăm dò, nhóm nghiên cứu đã quyết định sử dụng huyết thanh làm môi trường bảo quản các tế bào máu Thí nghiệm được thực hiện với tỷ lệ huyết thanh và các tế bào máu là 1:1 Tổ hợp các tế bào máu được thiết lập theo tỷ lệ hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu tương ứng.

Tỉ lệ 51 ứng là 48:1:1, trong đó số lượng tế bào máu được phân phối vào từng lọ để đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định bao gồm hồng cầu người là 3,3 x 10^12 /L, bạch cầu giả định (hồng cầu ngỗng) là 6,36 x 10^9 /L, và tiểu cầu giả định (hồng cầu dê) là 112 x 10^9 /L.

3.4.2.1 Kết quả đánh giá độ đồng nhất

Mẫu tổ hợp được chia thành 50 lọ, mỗi lọ chứa 2 ml, phân thành 2 lô khác nhau (25 lọ/lô) Ngẫu nhiên lấy 10% mẫu từ mỗi lô (3 lọ) để kiểm tra độ đồng nhất ngay sau khi phân phối Độ đồng nhất của mẫu được đánh giá tương tự như các mẫu hồng cầu người, tiểu cầu giả định và bạch cầu giả định.

Bảng 3.7 Kết quả độ đồng nhất mẫu tổ hợp các tế bào máu

Kết quả phân tích thống kê cho thấy |Fthực nghiệm| < F lý thuyết (phụ lục 1.7) ở cả

3 loại tế bào máu, giả thuyết H0 được chấp nhận: số lượng các tế bào máu bảo quản trong huyết thanh là đồng nhất:

|Fthực nghiệm| = 2,0917 < F lý thuyết = 19 đối với hồng cầu người

|Fthực nghiệm| = 1,6316 < F lý thuyết = 19 đối với bạch cầu giả định

|Fthực nghiệm| = 4,5087 < F lý thuyết = 19 đối với tiểu cầu giả định

3.4.2.2 Kết quả đánh giá độ ổn định

Mẫu tổ hợp sau khi phân phối vào từng lọ sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 độ C Mỗi 5 ngày, sẽ ngẫu nhiên lấy 1 lọ từ mỗi lô để đánh giá độ ổn định, nhằm xác định tuổi thọ tối đa của mẫu.

Giả thiết rằng H0: à 1 = à 2 là hai lụ mẫu cú nồng độ ổn định và H1: à 1 # à 2 là 2 lô mẫu có nồng độ không ổn định (α = 0,05)

Sử dụng phương pháp kiểm định t và phần mềm Excel để đánh giá độ ổn định của mẫu tổ hợp bằng cách so sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu giữa hai lô thí nghiệm Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong số lượng hồng cầu.

Trong 90 ngày thử nghiệm, giá trị thực nghiệm t = 2,2848 lebih besar daripada t lý thuyết = 2,0739 (Phụ lục 1.8), sehingga giả thiết H0 tidak diterima Dengan demikian, jumlah hồng cầu dalam mẫu tổ hợp tidak ổn định pada ngày bảo quản ke-90.

Trong 85 ngày thử nghiệm, giá trị t thực nghiệm là 2,1420, lớn hơn t lý thuyết 2,0687 (Phụ lục 1.8), do đó giả thiết H0 không được chấp nhận Kết quả cho thấy số lượng hồng cầu trong mẫu tổ hợp không ổn định sau 85 ngày bảo quản.

80 ngày thử nghiệm: |𝑡𝑡ℎự𝑐 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚| = 2,1956 > 𝑡 𝑙ý 𝑡ℎ𝑢𝑦ế𝑡 = 2,0452 (Phụ lục 1.8) nên không chấp nhận giả thiết H0 Như vậy, số lượng hồng cầu trong mẫu tổ hợp không ổn định ở ngày bảo quản 80

Trong 75 ngày thử nghiệm, giá trị thực nghiệm t là 1,9275, nhỏ hơn t lý thuyết 2,0452, do đó giả thiết H0 được chấp nhận Kết quả cho thấy số lượng hồng cầu trong mẫu tổ hợp ổn định trong thời gian bảo quản 75 ngày Đối với bạch cầu và tiểu cầu, kết quả cũng cần được xem xét để đánh giá sự ổn định trong thời gian này.

90 ngày thử nghiệm: |tthực nghiệm| = 0,9785 < t lý thuyết = 2,0518 đối với bạch cầu (Phụ lục 1.8) |tthực nghiệm| = 0,2730 < t lý thuyết = 2,0301 đối với tiểu cầu(Phụ lục

1.8) nên chấp nhận giả thiết H0 Như vậy, bạch cầu và tiểu cầu trong mẫu tổ hợp ổn định trong thời gian bảo quản 90 ngày

Bảng 3.8 Kết quả độ ổn định mẫu tổ hợp các tế bào máu trong 90 ngày

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn số lượng các tế bào máu trong mẫu tổ hợp trong 90 ngày

Nghiên cứu cho thấy các tế bào máu được bảo quản trong môi trường huyết thanh duy trì độ đồng nhất và ổn định trong 75 ngày, với số lượng hồng cầu dao động từ 2,82 – 3,37 x 10^12/L, bạch cầu từ 6,00 – 6,25 x 10^9/L và tiểu cầu từ 116 – 129 x 10^9/L Kết quả này có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.

Nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu bảo quản mẫu sinh phẩm huyết học với số lượng tế bào máu ổn định trong 3 tháng Để đạt được điều này, môi trường huyết thanh sẽ được bổ sung một số chất với nồng độ phù hợp nhằm kéo dài thời gian bảo quản.

Để đạt được kết quả tốt nhất trong việc bảo quản mẫu, các thành phần bổ sung vào môi trường sẽ được nghiên cứu trong chuyên đề "Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào máu" và chuyên đề "Tối ưu hóa thành phần dung dịch chứa tế bào máu".

3.4.3 Khảo sát sức bền các tế bào hồng cầu

Mẫu tổ hợp ba loại tế bào đều có chung đặc điểm là tế bào hồng cầu, bao gồm tế bào hồng cầu người, tế bào hồng cầu ngỗng thay thế bạch cầu và tế bào hồng cầu dê thay thế tiểu cầu Chúng tôi tiến hành xác định độ bền của cả ba loại tế bào này trong môi trường NaCl với nồng độ dao động từ 0,6% đến 0,26%.

Kết quả khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến số lượng các tế bào máu 59 3.6 Kết quả tối ưu hóa thành phần dung dịch chứa tế bào máu

Dựa trên kết quả khảo sát môi trường, các tế bào máu và huyết thanh được chọn để bảo quản nhằm duy trì số lượng tế bào máu, đồng thời bổ sung một số chất kháng sinh và tá dược cần thiết.

60 sung nhằm tăng độ nhớt, hạn chế sự nhiễm khuẩn, nấm, đảm bảo độ ổn định của các huyết cầu tố và giảm sự tán huyết

Thiết kế Plackett-Burman được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến nồng độ tế bào máu, với mỗi yếu tố được kiểm tra ở hai mức độ: thấp (-1) và cao (+1) Các yếu tố bao gồm huyết thanh, neomycin sulfate, chloramphenicol, sodium azide và tá dược, như được liệt kê trong bảng 3.5 Phân tích kết quả nghiên cứu được thực hiện bằng phần mềm “Design expert®7.0” của Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA Nồng độ của neomycin sulfate và chloramphenicol được điều chỉnh nhằm tìm khoảng nồng độ tối ưu để đảm bảo sự ổn định của tế bào máu trong quá trình bảo quản và vận chuyển Sodium azide NaN3 và tá dược được bổ sung để tăng tính kháng nấm, cải thiện độ nhớt và giảm hiện tượng tán huyết trong môi trường bảo quản (bảng 3.10).

Mẫu sinh phẩm dùng trong xét nghiệm huyết học lâm sàng cần được bảo quản lâu dài để các phòng xét nghiệm có đủ thời gian thực hiện xét nghiệm và Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Thành phố có thể triển khai mẫu cho tất cả các đơn vị tham gia chương trình ngoại kiểm trên toàn quốc Thời gian bảo quản tối ưu được nhóm nghiên cứu xác định là 3 tháng, với nhiệt độ bảo quản từ 2 đến 8 độ C.

Nồng độ các tế bào máu trong môi trường bảo quản 100 ml được xác định với giá trị bình thường của người: hồng cầu đạt 4,12 x 10^12/L, bạch cầu (hồng cầu ngỗng) là 6,3 x 10^9/L, và tiểu cầu (hồng cầu dê) là 195 x 10^9/L.

Với 5 yếu tố được chọn để sàng lọc gồm huyết thanh, neomycin sulfate, chloramphenicol, sodium azide và tá dược với hai mức thấp và cao (bảng 3.10) tiến hành thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman (bảng 3.11) Qua kết quả xử lý bằng phần mềm Design expert 7.0 cho thấy (phụ lục 3.1), các yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn sẽ được chọn là yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu theo dõi

Bảng 3.10 Các yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận

Bảng 3.11 Kết quả ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ở mẫu có mức nồng độ trung bình

Hồng cầu người Bạch cầu

Bảng 3.12 Các biến trong ma trận Plackett-Burman và ảnh hưởng của chúng

Yếu tố Mức Mức độ ảnh hưởng

F Ảnh hưởng Prob > F Ảnh hưởng

1 3 2,167E-004 a 0,0478 0,25 a 0,0350 7,83 a 0,0069 a Có ý nghĩa ở độ tin cậy  b Không có ý nghĩa ở độ tin cậy 

Kết quả phân tích cho thấy ba chỉ tiêu theo dõi (hồng cầu người, hồng cầu ngỗng thay thế bạch cầu và hồng cầu dê thay thế tiểu cầu) chịu ảnh hưởng lớn nhất bởi ba yếu tố: huyết thanh (% v/v), neomycin sulfate (g/l) và tá dược (% v/v) với độ tin cậy p < 0,1 Sàng lọc cho thấy độ pha loãng giữa tỷ lệ huyết thanh và các tế bào máu, cùng với nồng độ kháng sinh neomycin sulfate và tỷ lệ tá dược, có tác dụng tăng độ nhớt, ảnh hưởng đến sự ổn định số lượng tế bào máu Những yếu tố này sẽ được chọn để mở rộng nghiên cứu cho thiết kế tối ưu hóa theo RSM-CCD.

Bảng 3.13 Nồng độ các yếu tố ảnh hưởng sử dụng trong thiết kế thí nghiệm CCD Tên yếu tố

3.6 Kết quả tối ưu hóa thành phần dung dịch chứa tế bào máu

3.6.1 Kết quả tối ưu hoá thành phần các chất trong môi trường bảo quản

Sau khi phân tích các yếu tố chính ảnh hưởng đến số lượng tế bào máu, bao gồm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, quá trình tối ưu hóa thực nghiệm đã được thực hiện theo phương pháp RSM-CCD Dữ liệu thu thập được đã được xử lý bằng phần mềm Design Expert® 7.0.0.

Nồng độ các tế bào máu trong môi trường bảo quản 100 ml được xác định với giá trị bình thường của con người: hồng cầu đạt 4,12 x 10^12/L, bạch cầu giả định (hồng cầu ngỗng) là 6,3 x 10^9/L, và tiểu cầu giả định (hồng cầu dê) là 195 x 10^9/L.

Thành phần chất trong môi trường bảo quản được thiết lập ở ngưỡng khảo sát, với số lượng tế bào máu được quy định trong các khoảng giá trị cụ thể: hồng cầu người từ 3,5 đến 4,5 x 10^12/L, bạch cầu giả định từ 4,5 đến 8,5 x 10^9/L, và tiểu cầu giả định.

Số lượng tế bào máu được xác định trong khoảng từ 150 đến 250 x 10^9/L Thời gian bảo quản mẫu là 3 tháng ở nhiệt độ từ 2 đến 8 độ C Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược, cũng như sự tương tác giữa các yếu tố này đến hàm mục tiêu, đã được thực hiện thông qua việc xây dựng hàm hồi quy bậc 2.

Yi là hàm mục tiêu trong mô hình thống kê, với b0 là hệ số tự do và bi, bii, bij là các vectơ tham số xác định qua thực nghiệm Mô hình này chỉ có giá trị khi đáp ứng các tiêu chuẩn thống kê theo quy định của Fisher.

Bảng 3.14 Tối ưu hoá môi trường bảo quản theo RSM – CCD ở mẫu có nồng độ trung bình

Huyết thanh Neomycin sulfate Tá dược Nồng độ tế bào máu (x 10 9 /L)

Ký hiệu mức tiến hành

Sau khi thực hiện phân tích phương sai (ANOVA), phần mềm DX7 đã cung cấp giá trị hàm mong đợi, được sử dụng làm mô hình dự đoán cho số lượng hồng cầu ở người (Y1), số lượng bạch cầu giả định (hồng cầu ngỗng, Y2) và số lượng tiểu cầu giả định (hồng cầu dê, Y3).

Số lượng các tế bào máu được biểu diễn theo phương trình cụ thể như sau:

Trong nghiên cứu này, các giá trị hàm lượng huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược được biểu diễn bằng x1, x2, x3 Hệ số hồi quy (R2) cho số lượng hồng cầu người (Y1) đạt 0,9329, cho thấy 93,29% dữ liệu thực nghiệm phù hợp với mô hình dự đoán Giá trị R2 lớn hơn 0,75 cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa các yếu tố thí nghiệm và số lượng hồng cầu Hệ số R2 tiên đoán là 0,8439, phù hợp với R2 điều chỉnh 0,9019, với độ lệch nhỏ hơn 0,2 Tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu là 21,190, vượt mức 4, chứng tỏ tín hiệu đã đầy đủ.

Số lượng bạch cầu giả định (hồng cầu ngỗng thay thế, Y2) cho hệ số hồi quy (R2) là 0,9129, cho thấy 91,29% dữ liệu thực nghiệm tương thích với mô hình dự đoán Giá trị R2 lớn hơn 0,75 cho thấy mô hình có sự tương quan chặt chẽ với các yếu tố thí nghiệm và số lượng bạch cầu giả định R2 tiên đoán đạt 0,7432, phù hợp với R2 điều chỉnh 0,8620, với độ lệch 0,1188 nhỏ hơn 0,2 Tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu là 12,940, vượt mức 4, chứng tỏ rằng tín hiệu đã đầy đủ.

Mô hình dự đoán số lượng tiểu cầu giả định (hồng cầu dê thay thế, Y3) đạt hệ số hồi quy (R2) là 0,9091, cho thấy 90,91% số liệu thực nghiệm tương thích với dữ liệu dự đoán Giá trị R2 lớn hơn 0,75 cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa các yếu tố thí nghiệm và số lượng hồng cầu ở người Hơn nữa, giá trị R2 tiên đoán là 0,6968 và R2 điều chỉnh là 0,8430, với độ lệch 0,1462 nhỏ hơn 0,2 Tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu là 15,577, vượt mức 4, chứng tỏ rằng tín hiệu đã đầy đủ.

Kết quả khảo sát tuổi thọ của mẫu trong điều kiện bảo quản 2-8 0 C và trong điều kiện vận chuyển

Mẫu tổ hợp tế bào máu có hạn sử dụng 3 tháng, nhưng để xác định chính xác tuổi thọ thực sự sau khi bổ sung môi trường tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát định kỳ mỗi 5 ngày từ thời điểm 3 tháng bảo quản Việc này sẽ tiếp tục cho đến khi một trong các chỉ số bạch cầu, tiểu cầu hoặc hồng cầu không còn đạt giá trị ban đầu.

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng mẫu có mức nồng độ trung bình (bạch cầu: 7,5 x10 9 /l, hồng cầu: 4,15 x10 12 /l, tiểu cầu: 154 x10 9 /l) và phân tích số lượng tế bào

Máy ABX Micros 60 có khả năng phân tích 69 loại tế bào máu Đồng thời, mẫu máu cũng sẽ được gửi đến một phòng xét nghiệm khác có trang bị máy ABX Micros để kiểm tra ảnh hưởng của điều kiện vận chuyển đến chất lượng của mẫu.

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát tuổi thọ của mẫu tại PXN Trung tâm KCXN và PXN đối chiếu

Phòng xét nghiệm TTKCXN PXN đối chiếu

Theo bảng 3.15, trong điều kiện bảo quản từ 2-8 °C tại phòng xét nghiệm, số lượng tế bào máu giữ ổn định từ 3 tháng đến 4 tháng 10 ngày Tuy nhiên, sau 4 tháng 15 ngày, số lượng hồng cầu bắt đầu giảm, trong khi số lượng bạch cầu và tiểu cầu lại tăng Đặc biệt, số lượng hồng cầu giảm rõ rệt trong điều kiện vận chuyển.

Mẫu xét nghiệm tại phòng TTKCXN cho thấy sự gia tăng số lượng tiểu cầu, có thể do tế bào hồng cầu bị thoái hóa hoặc vỡ thành mảnh nhỏ, dẫn đến sự hình thành các tiểu cầu giả Đồng thời, các tiểu cầu này có thể kết dính với nhau, tạo thành khối tế bào lớn giống như bạch cầu, từ đó làm tăng kết quả phân tích số lượng bạch cầu.

Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi số lượng các tế bào máu sau 5 tháng

Bên cạnh việc phân tích số lượng các tế bào máu trên máy phân tích ABX Micros

Sau 5 tháng theo dõi, chúng tôi nhận thấy sự thay đổi màu sắc rõ rệt của mẫu tổ hợp Cụ thể, sau 3 tháng, mẫu có màu đỏ đậm, nhưng sau 4 tháng, màu sắc trở nên đậm hơn, và đến 4,5 tháng, mẫu đã chuyển sang màu đen.

Sau 4,5 tháng, chúng tôi tiến hành nhuộm Giemsa để đánh giá chất lượng mẫu và quan sát hình thái tế bào Kết quả cho thấy hình dạng của các tế bào hồng cầu người và hồng cầu ngỗng không có sự thay đổi đáng kể, và không có hiện tượng vỡ tế bào hồng cầu So sánh với mẫu ngoại kiểm của công ty Randox, hình dạng tế bào hồng cầu người của chúng tôi cũng tương đồng với mẫu của họ.

(A) Mẫu tổ hợp ban đầu (B) Mẫu tổ hợp sau 4 tháng

(C) Mẫu ngoại kiểm của công ty Randox

Hình 3.22 Hình dạng của các tế bào máu sau khi nhuộm bằng Giemsa ở vật kính X100

(A) Mẫu tổ hợp ban đầu, (B) Mẫu tổ hợp sau 4 tháng, (C) Mẫu ngoại kiểm của công ty Randox

Sử dụng phương pháp kiểm định t và phần mềm Excel, nghiên cứu này đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu tổ hợp tại phòng xét nghiệm của TTKCXN và phòng xét nghiệm đối chiếu Việc so sánh từng cặp số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu được thực hiện nhằm kiểm tra giả thuyết H0: μ1 = μ2, tức là hai lô mẫu từ hai phòng xét nghiệm có nồng độ tương đồng, trong khi H1 cho thấy sự khác biệt giữa chúng.

≠μ2 là 2 lô mẫu của 2 phòng xét nghiệm có nồng độ không tương đồng (mức ý nghĩa α

Kết quả phân tích thống kê cho thấy tại thời điểm 4 tháng 10 ngày, các chỉ số bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu giữa hai phòng xét nghiệm tương đồng, với |tthực nghiệm| nhỏ hơn t lý thuyết Cụ thể, |tthực nghiệm| của bạch cầu là 0,4602, hồng cầu là 0,8773 và tiểu cầu là 0,9486, đều thấp hơn các giá trị t lý thuyết tương ứng Tuy nhiên, tại thời điểm 4 tháng 15 ngày, các chỉ số này không còn tương đồng, khi |tthực nghiệm| của bạch cầu đạt 2,1476, hồng cầu 2,7969 và tiểu cầu 2,1569, đều lớn hơn t lý thuyết 2,1098 Do đó, giả thuyết H0 không được chấp nhận tại thời điểm này.

(phụ lục 1.11) Do đó, ở thời điểm này số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu cũng không tương đồng với nhau

Trong điều kiện bảo quản tại phòng xét nghiệm của TTKCXN, mẫu sau khi bổ sung các thành phần theo công thức môi trường tối ưu có tuổi thọ tối đa là 4 tháng 10 ngày Tuy nhiên, trong quá trình vận chuyển, chúng tôi xác định tuổi thọ của mẫu là 4 tháng.

Mẫu ngoại kiểm của chúng tôi có thời hạn sử dụng lâu hơn so với các sản phẩm của Randox trên thị trường Tuy nhiên, mẫu của chúng tôi chỉ giới hạn ở 3 thông số, trong khi mẫu của Randox có khả năng đánh giá tới 11 thông số.

Mẫu sinh phẩm của chúng tôi đã đạt được thành công bước đầu với tuổi thọ dài, đủ để triển khai cho các đơn vị, đồng thời tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn trong tương lai.

Kết quả xác định giá trị tối thiểu số lượng các loại tế bào máu trong môi trường tối ưu

3.8.1 Kết quả sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng

Nghiên cứu MX 056 xác định ngưỡng nồng độ thấp nhất cho mẫu nghiên cứu với số lượng hồng cầu từ 2 – 3,5 x 10^12/L, bạch cầu từ 2,0 – 4,5 x 10^9/L và tiểu cầu từ 90 – 150 x 10^9/L Khoảng nồng độ này được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong ma trận Placket-Burman và tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD Mẫu được bảo quản cố định trong 3 tháng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C.

Với 5 yếu tố được chọn để sàng lọc gồm huyết thanh, neomycin sulfate, chloramphenicol, sodium azide và tá dược với hai mức thấp và cao (bảng 3.16) tiến hành thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman (bảng 3.17) Qua kết quả xử lý bằng phần mềm Design expert 7.0 (phụ lục 3.2) cho thấy, các yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn sẽ được chọn là yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu theo dõi

Bảng 3.16 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman ở mẫu có nồng độ tối thiểu

Bảng 3.17 Kết quả ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ở mẫu có nồng độ tối thiểu

1 3 1,833E-004 a 0,0918 0,33 a 0,0171 10,67 a 4, xác nhận rằng tín hiệu đã đầy đủ Đối với số lượng tiểu cầu giả định (hồng cầu dê thay thế, Y3), hệ số hồi quy (R2) là 0,8940, cho thấy 89,40% dữ liệu thực nghiệm cũng tương thích.

Mô hình dự đoán với giá trị R2 lớn hơn 0,75 cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa các yếu tố thí nghiệm và số lượng hồng cầu ở người Giá trị R2 tiên đoán đạt 0,6775, trong khi R2 điều chỉnh là 0,8322, với độ lệch 0,1547 nhỏ hơn 0,2 Tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu là 15,162, vượt qua ngưỡng 4, cho thấy tín hiệu đã đủ mạnh.

Mặt đáp ứng thể hiện sự tương tác của từng cặp yếu tố tạo ra hàm đáp ứng cực đại, với huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược được cài đặt ở mức khảo sát Số lượng tế bào máu được xác định trong khoảng nồng độ nhất định: hồng cầu người từ 2,0 – 3,5 x 10^12/L, bạch cầu từ 2,0 – 4,5 x 10^9/L và tiểu cầu từ 90 – 150 x 10^9/L Qua xử lý bằng phần mềm DX7, 30 giải pháp đã được tìm ra để đáp ứng hàm cực đại Để chọn giải pháp tối ưu, chúng tôi dựa vào tỷ lệ huyết thanh trong môi trường bảo quản, với giải pháp thứ 2 có hàm lượng huyết thanh thấp nhất là phù hợp với mục đích nghiên cứu Giá trị tối ưu cho huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược lần lượt là 45,36%; 0,5 g/l; 2,6% Mô hình dự đoán số lượng tế bào hồng cầu người tối đa đạt 3,1 x 10^12/L, hồng cầu ngỗng đạt 3,4 x 10^9/L và hồng cầu dê đạt 121 x 10^9/L.

Mặt đáp ứng số lượng hồng cầu người theo tỷ lệ neomycin sulfate và huyết thanh, cũng như theo tỷ lệ tá dược và huyết thanh Ngoài ra, mặt đáp ứng cũng được phân tích theo tỷ lệ tá dược và neomycin sulfate.

Mặt đáp ứng số lượng hồng cầu ở người được phân tích theo tỷ lệ huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược Đồng thời, mặt đáp ứng số lượng bạch cầu giả định cũng được khảo sát dựa trên tỷ lệ tá dược và huyết thanh, cũng như tỷ lệ tá dược và neomycin sulfate.

Hình 3.24 Mặt đáp ứng số lượng bạch cầu giả định theo tỷ lệ huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược

Mặt đáp ứng số lượng tiểu cầu giả định theo tỷ lệ neomycin sulfate và huyết thanh, cũng như theo tỷ lệ tá dược và huyết thanh, cho thấy sự tương tác quan trọng giữa các thành phần này trong việc điều chỉnh tiểu cầu Việc hiểu rõ các tỷ lệ này có thể giúp cải thiện quy trình nghiên cứu và ứng dụng trong y học.

Hình 3.25 Mặt đáp ứng số lượng tiểu cầu giả định theo tỷ lệ huyết thanh, neomycin sulfate và tá dược

3.8.3 Kết quả đánh giá mô hình thực nghiệm Để kiểm tra kết quả của mô hình, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các giá trị dự đoán để thu được số lượng các tế bào máu theo giá trị được cài đặt Số lượng các tế bào máu thu được từ kết quả thực nghiệm là hồng cầu người 3,11 x 10 12 /L, bạch cầu giả định 3,4 x 10 9 /L, tiểu cầu giả định 123 x 10 9 /L Sự tương quan chặt chẽ giữa hai kết quả tính toán giúp khẳng định tính chính xác của mô hình và sự tồn tại của điểm tối ưu

Kết quả xác định giá trị cực đại số lượng các loại tế bào máu trong môi trường tối ưu

3.9.1 Kết quả sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng

Nhóm nghiên cứu đã xác định ngưỡng nồng độ cực đại cho mẫu nghiên cứu MX 056 ở ba mức: thấp, bình thường và cao, với số lượng hồng cầu từ 4,5 – 5,5 x 10^12/L, bạch cầu từ 8,5 – 30 x 10^9/L và tiểu cầu từ 250 – 500 x 10^9/L Các nồng độ này được sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong ma trận Placket-Burman và tối ưu hóa bằng phương pháp RSM-CCD Mẫu được bảo quản trong thời gian 3 tháng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C.

Với 5 yếu tố được chọn để sàng lọc gồm huyết thanh, neomycin sulfate, chloramphenicol, sodium azide và tá dược với hai mức thấp và cao (bảng 3.21) tiến hành thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman (bảng 3.22) Qua kết quả xử lý bằng phần mềm Design expert 7.0 (phụ lục 3.3) cho thấy, các yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn sẽ được chọn là yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu theo dõi

Bảng 3.21 Các yếu tố khảo sát sàng lọc theo ma trận Plackett-Burman

Bảng 3.22 Kết quả ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ở mẫu có nồng độ cực đại

1 3 3,167E-004 a 0,0133 0,30 a 0,0234 7,83 a

Tiêu đề	Nghiên cứu chế tạo mẫu sinh phẩm đo số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết học
Tác giả	TS. Trần Hữu Tâm
Trường học	Trường Đại Học Y Dược TP.HCM
Chuyên ngành	Y Dược
Thể loại	báo cáo
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	195
Dung lượng	9,11 MB