- - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: “So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.” ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có nhiều loại thuốc Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác Berberin chủ yếu thân rễ vàng đắng với tỷ lệ 1,53%[1] Berberin biết đến với tác dụng bật kìm khuẩn tả E.coli, điều trị bệnh lỵ Thuốc sử dụng phổ biến giá thành thấp an tồn, khơng ảnh hưởng tới phát triển bình thường vi khuẩn có ích ruột Hiện thị trường có dạng bào chế Berberin như: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao… Vì vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc thành phẩm quan trọng Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu chế phẩm viên nén Berberin phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dược điển Trung Quốc (2005) định lượng Berberin HPLC Để có sở lựa chọn phương pháp định lượng Berberin thích hợp, chúng tơi tiến hành thực đề tài : “ So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III” với mục tiêu sau:  Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)  Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III  So sánh hai phương pháp định lượng để tìm phương pháp thích hợp cho việc định lượng berberin sở kiểm tra chất lượng thuốc nước PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ BERBERIN: 1.1.1 Cấu trúc: Beberin alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung protoberberin[1] Isoquinolin cịn gọi benzo[c] pyridin hay 2benzamin hợp chất hữu thơm heterocyclic[18] This image cannot currently be display ed Cấu trúc isoquinolin Công thức cấu tạo: This image cannot currently be display ed Công thức phân tử: C20H18NO4+ Tên khoa học : PTL: 336.36 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2 Nguồn gốc: Berberin thường có rễ, thân rễ, thân, vỏ thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18] Berberin có nhiều thân rễ vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm 82% so với alcaloid tồn phần [9] Berberin thường có lẫn tạp chất alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin Giới hạn tạp chất palmatin không 2%, jatrorrhizin không % [6],[13] 1.1.3 Tính chất - Bột kết tinh màu vàng, khơng mùi, có vị đắng Tan nước nóng, khó tan ethanol nước lạnh, khó tan cloroform, không tan ether.[6] 1.5 Tác dụng dược lý: - Berberin có tác dụng kháng vi trùng như: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [12], [17] - Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả E.coli, đặc biệt dùng không ảnh hưởng tới phát triển bình thường hệ vi khuẩn có ích ruột, dùng phối hợp với số thuốc kháng sinh hạn chế tác dụng phụ gây thuốc kháng sinh hệ sinh vật đường ruột [17] - Berberin có tác dụng ức chế tiết ion lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol trigycerid, chống tiểu đường, ức chế nhịp nhanh thất, giảm viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu cầu tiên phát thứ phát, kích thích tiết mật thải trừ bilirubin[17] Chỉ định: [9],[12],[17] - Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật đặc biệt bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt - Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ kích thích bên ngồi( nắng, gió, lạnh, bụi, khói…) điều trị bệnh đau mắt hột - Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas 1.1.6 Chống định: [17] - Phụ nữ có thai khả gây co bóp tử cung berberin - Người dị ứng với berberin ( gặp) 1.1.7 Dạng thuốc hàm lượng: [11] - Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lượng 10 mg, 50100 mg/ viên - Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ kích thích bên ngồi (gió, nắng, lạnh, bụi, khói) 1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN: 1.2.1 Phương pháp thể tích: [5], [13] Hịa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào cốc với 150ml nước sôi Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml Lấy xác 50ml dung dịch kali dicromat 0,1N thêm nước tới vạch Lắc phút, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu Lấy xác 100ml dịch lọc cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau thêm 10 ml dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối 10 phút Chuẩn độ dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tương đương thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột tiếp tục chuẩn độ màu xanh biến dừng Song song tiến hành làm mẫu trắng điều kiện 1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tương ứng với 12,39 mg C20 H18NO4Cl 1.2.2 Phương pháp đo UV-VIS  Phương pháp 1:[6] * Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm hòa tan 200ml nước cách đun nóng Sau làm lạnh thêm nước đến 1000ml Lấy 10ml dung dịch pha loãng với nước đến 100ml * Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử chuẩn sấy khô 1100C giờ, hòa tan nước Thêm 10ml dung dịch acid sulfuric 1N thêm nước vừa đủ 1000ml * Đo độ hấp thụ: Đo At As dunh dịch thử dung dịch chuẩn bước sóng 421 nm * Cách tính: Lượng ( mg) C20H18NO4Cl tính cơng thức sau: P= At × ×a As 1,006 a: khối lượng ( mg) kali dichromat  Phương pháp [6] Xác định hàm lượng berberin clorid viên nén * Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột viên tương đương với khoảng 80 mg berberin clorid, thêm 10ml nước để thấm bột viên, sau thêm khoảng 200ml nước sôi, khuấy kĩ phút, để nguội chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nước tới vạch, lắc Để lắng tự nhiên đem ly tâm Lấy xác 5ml dung dịch đem pha loãng với nước cất vừa đủ 100ml * Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid * Mẫu trắng: nước cất * Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch thử chuẩn điều kiện bước sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy cm 1.2.3 Phương pháp cân [5] Áp dụng để định lượng viên nén berberin clorid, dựa khả tạo tủa berberin với acid picric Cân 20 viên nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột viên tương ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, thêm methanol đến ngấn Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu Lấy 100ml dịch lọc Làm bay khô cách thủy, thêm 150ml dung dịch NaOH 0,1N 90ml nước, đun nóng Lắc kỹ để hòa tan Để nguội lọc qua giấy lọc thấm ướt Rửa phễu giấy lọc lần, lần 10ml nước Gộp dịch lọc nước rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N tiếp tục cho từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT) Lắc Để yên qua đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đường kính lỗ xốp 10 – 16 µm ( cân bì) để lấy tủa Rửa tủa lần với nước cất khoảng 150C, lần 15ml nước, hút kiệt nước sấy khô phễu tủa 1000C đến khối lượng không đổi Khối lượng tủa xác định P (g) g tủa tương ứng với 0,6586 g C20H18NO4Cl 1.2.4 Phương pháp HPLC  Phương pháp 1:[14], [15] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x mm) nhồi hạt silicagel octadecylsilan hóa có đường kính µm - Nhiệt độ cột: 400C - Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat 1,7g natri laurylsulfat 1000 ml hỗn hợp dung môi nước acetonitril (1:1) - Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng cho thời gian lưu berberin khoảng 10 phút - Detector UV bước sóng 345 nm - Thể tích tiêm: 10 µl - Nồng độ dung dịch thử chuẩn: 0,1mg/ml cách tiến hành pha dung dịch giống * Tiến hành: Lần lượt tiêm dung dịch thử chuẩn Dựa vào đáp ứng pic berberin dung dịch thử , chuẩn hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng berberin chế phẩm * Cách tính: Lượng Wt (mg) berberin clorid (C20H18ClNO4) Wt = Ws x (At / As) Ws = Lượng (mg) berberin chuẩn, tính theo lượng khan  Phương pháp 2: [13] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột nhồi hạt silicagel octadecylsilan hóa - Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 acid phosphoric] acetonitril (60:40) - Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút - Detector UV bước sóng 263 nm - Thể tích tiêm: 20 µl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: 32 µg/ml * Tiến hành: Lần lượt tiêm dung dịch thử chuẩn Dựa vào đáp ứng pic berberin dung dịch thử, chuẩn hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng berberin có chế phẩm  Phương pháp 3: [16] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( µm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42) - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector UV bước sóng 349 nm * Tiến hành: Tương tự phương pháp HPLC trình bày 1.3 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.3.1 Nguyên tắc Phương pháp HPLC phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách định lượng thành phần hỗn hợp dựa lực khác chất với pha tiếp xúc khơng hịa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu cao) pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch hỗn hợp chất cần phân tích đưa vào cột, chúng hấp phụ phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào chất cột chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động bơm với áp suất cao tùy thuộc vào lực chất với hai pha, chúng di chuyển qua cột với vận tốc khác dẫn đến phân tách Các chất sau khỏi cột phát phận phát gọi detector chuyển qua xử lý kết Kết cuối hiển thị hình đưa máy in [8] 1.3.2 Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách kỹ thuật HPLC trình vận chuyển phân bố chất tan pha khác Khi pha động di chuyển với tốc độ định qua cột sắc ký đẩy chất tan bị pha tĩnh lưu giữ khỏi cột Tùy theo chất pha tĩnh, chất tan dung mơi mà q trình rửa giải tách chất khỏi cột sắc ký Nếu ghi q trình tách sắc ký, có sắc đồ [8], [11] 1.3.3 Các thông số đặc trưng trình sắc ký: Kết q trình sắc kí detector phát hiện, phóng đại ghi thành sắc ký đồ( hình 1): t R2 t R1 to W 0.5-1 t' R1 W 0.5-2 W b1 W b2 t' R2 Hình 1: sắc ký đồ chất thơng số đặc trưng Trong : to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách tR (thời gian lưu): thời gian kể từ chất cần phân tích bơm vào cột xuất đỉnh pic chất cần phân tích tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to W0,5: Độ rộng pic nửa chiều cao Wb: Độ rộng đáy pic 1.3.2.1 Hệ số dung lượng k’ t' k' t = R = t −t t R 10 = t t R −1 [8] DiÖn tÝch pic (mAU.min) y = 0.377x + 0.002 R = 0,999 16 14 12 10 0 10 15 20 25 30 35 40 45 C(µg/ml) Hình 10: Đồ thị biễu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ dung dịch - Phương trình hồi quy mối tương quan diện tích pic nồng độ dung dịch là:y = 0,377x + 0,002 - Hệ số tương quan: R = 0,9999 - Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb = 0,003 - Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy y_intercept: b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay - 0,007 < y_intercept